تحديد الأحماض الأمينية في الحل. التحليل النوعي المقارن للأحماض الأمينية. طرق تحديد الأحماض الأمينية

ستناقش هذه المقالة طرق تحديد الأحماض الأمينية المستخدمة ليس فقط في تحليل المنتجات، ولكن أيضًا في الكيمياء الحيوية والتحليل الدوائي.

يمكن تحديد الكمية الإجمالية للأحماض الأمينية بطريقة القياس الضوئي بناءً على تحديد الأمونيا التي تم الحصول عليها من الأحماض الأمينية باستخدام طريقة كيلدال.

التفاعل مع 1-نفثول. لتحديد الأرجينين والهيستيدين والتيروزين، تم اقتراح التفاعل مع 1-نفثول. في وجود هيبوكلوريت الصوديوم (NaOCl)، يتحول المحلول إلى اللون الأحمر. يتم تبريد محلول العينة الذي يحتوي على 50% من الإيثانول والذي يحتوي على حمض أميني بالثلج ويتم إضافة محلول NaOCl 10% ومحلول النفثول. منتج التفاعل ملون باللون الأحمر (الحد الأقصى = 550 نانومتر). يتم تحديد محتوى الأحماض الأمينية من خلال كثافة لون المحلول الناتج.

رد فعل بيوريت. من أهم التفاعلات المستخدمة لتحديد الأحماض الأمينية هو تفاعل البيوريت. يتم التفاعل بإضافة محلول مائي مخفف من ملح النحاس (II) إلى محلول قلوي من البيوريت. في هذه الحالة، يتحول المحلول إلى اللون الأرجواني الشديد بسبب تكوين مركب معقد.

يتضمن تفاعل البيوريت مركبات تحتوي على مجموعتي أميد على الأقل أو مجموعة أمينوهيدروكسي إيثيلين، بالإضافة إلى أميدات وإيميدات الأحماض الأمينية. يتم تنفيذ هذا التفاعل بواسطة البروتينات والمحاليل المركزة للأحماض الأمينية والأميدات. لا تعطي المحاليل المخففة للأحماض الأمينية تفاعل البيوريت وبالتالي يمكن استخدام التفاعل لتحديد نهاية التحلل المائي للبروتين. يستخدم التفاعل أيضًا في التحديد النوعي والكمي للبروتين. تعتمد الطرق المستخدمة في مختبرات التشخيص السريري لتحديد البروتين في الدم والسوائل البيولوجية الأخرى على تفاعل البيوريت.

تفاعل النينهيدرين. ثاني أهم تفاعل يستخدم لتحديد الأحماض الأمينية هو تفاعل النينهيدرين - وهو تفاعل اللون للأحماض الأمينية، والذي يتم عن طريق تسخين الأخير في محلول قلوي من النينهيدرين الزائد.

يقوم النينهيدرين بنزع الكربوكسيل التأكسدي للأحماض الأمينية مع تكوين الأمونيا وثاني أكسيد الكربون والألدهيد، التي تحتوي على ذرة كربون أقل من الحمض الأميني الأصلي. يتفاعل النينهيدرين المختزل بعد ذلك مع الأمونيا المتحررة وجزيء النينهيدرين الثاني، مكونًا منتج تكثيف ملون مع الأمونيا.

المركب الناتج (الصباغ) له لون أزرق بنفسجي (l max = 570 nm). يتم استخدام تكوين هذا المركب الملون في اختبار الأحماض الأمينية الكمي، والذي يمكنه اكتشاف الأحماض الأمينية حتى بكميات صغيرة تصل إلى 1 ميكروغرام.

يتفاعل البرولين والهيدروكسي برولين، اللذان لا يحتويان على مجموعة أمينية، مع النينهيدرين لتكوين مشتقات صفراء (الحد الأقصى = 440 نانومتر). رد الفعل ليس محددا، لأن الأمونيا والمركبات التي تحتوي على مجموعة أمينية (الأمينات والبروتينات والببتيدات) تنتج أيضًا منتجًا ملونًا يحتوي على النينهيدرين. ومع ذلك، لا يتم إطلاق ثاني أكسيد الكربون مع هذه المركبات. إن إطلاق ثاني أكسيد الكربون هو سمة مميزة فقط للأحماض الأمينية. يُستخدم التفاعل في التحديد الكمي اللوني للأحماض الأمينية، بما في ذلك في أجهزة تحليل الأحماض الأمينية الأوتوماتيكية (قياس حجم ثاني أكسيد الكربون).

يتم استخدام تفاعل النينهيدرين لتحديد الجليسين، والإيسولوسين، والليوسين؛ سيرين، فينيل ألانين، سيستين، تيروزين، تريبتوفان، وما إلى ذلك تعطي ألوانًا أقل كثافة.

وتتميز المنتجات الناتجة بلون كثيف إلى حد ما (e = 1.8–3.3·10 4)، ولكن المنتجات الملونة غير مستقرة. كثافة اللون تنخفض بسرعة. يضاف CdCl 2 لتحقيق الاستقرار. يشكل مجمعات مستقرة مع المركبات الناتجة. كما يعمل كلوريد الكادميوم على تسريع التفاعل.

تتكثف الأحماض الأمينية وبعض المركبات الأخرى التي تحتوي على مجموعة أمينية في وسط قلوي مع 1،2-نفثوكوينون - 4-سلفوكسيلات لتكوين مشتقات حمراء وصفراء وبرتقالية من 1،2-نفثوكوينون أحادي الأمين.

يتم استخدام التفاعل لتحديد أمينوكسيلات (حمض أميني أساسي، آيزوليوسين، ليوسين، وما إلى ذلك).

لتحديد التربتوفان، يمكن استخدام التفاعل مع 4-ثنائي ميثيل أمينوبنزالدهيد. يكون لون منتج التفاعل أرجوانيًا ويتم تحديد محتوى التربتوفان في المحلول الذي تم تحليله من خلال شدة اللون.

ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا التفاعل نادراً ما يستخدم في تحليل الأغذية.

للتقدير الكمي للأحماض الأمينية المحتوية على الكبريت، يتم استخدام طريقة البروماتوميتر، بناءً على التفاعل التالي:

يُسكب محلول السيستين في محلول NaOH 1٪ في دورق بسدادة أرضية، ويضاف إليه 0.1 N. محلول برومات البوتاسيوم وبروميد البوتاسيوم الجاف والمحمض بـ 10% HCl.

البروم 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

ويتفاعل البروم المتكون نتيجة التفاعل، والذي تعادل كميته كمية برومات البوتاسيوم، مع الحمض الأميني. بعد 10 دقائق، يُضاف يوديد البوتاسيوم، الذي يتفاعل مع البروم غير المتفاعل، ويُعاير اليود المتحرر بـ 0.1 N. محلول ثيوكبريتات الصوديوم مع النشا كمؤشر.

2I - + ر 2 → ر - + أنا 2

كمية الثيوسلفات المستخدمة في المعايرة تعادل كمية البروم التي لم تتفاعل مع الحمض الأميني. بناءً على الفرق بين كمية برومات البوتاسيوم المضافة والثيوكبريتات، يتم العثور على كمية البروم التي دخلت في التفاعل مع الحمض الأميني، وبالتالي كمية الحمض الأميني.

يتم تحديد الميثيونين بالمثل. يتأكسد الميثيونين إلى سلفون:

هذا التفاعل، في ظل ظروف معينة، يجعل من الممكن تحديد محتوى الميثيونين بدقة شديدة.



يمكن الكشف عن الأحماض الأمينية باستخدام تفاعلات الألوان: النينهيدرين، البروتين الزانثوبروتين، فولي، ميلون، اختبار البيوريت، وما إلى ذلك. هذه التفاعلات غير محددة، لأن تعتمد على اكتشاف الأجزاء الفردية في بنية الأحماض الأمينية، والتي يمكن العثور عليها أيضًا في مركبات أخرى.

تفاعل النينهيدرين، تفاعل لوني يستخدم في التحديد النوعي والكمي للأحماض الأمينية والأحماض الأمينية والأمينات. عند تسخينه في بيئة قلوية، يتكون النينهيدرين (ترايسيتوهيدرين ديهيدرات، C 9 H b O 4) مع المواد التي تحتوي على مجموعات أمينية أولية (-NH 2)، منتجًا ذو لون بنفسجي أزرق كثيف ثابت مع أقصى امتصاص يبلغ حوالي 570 نانومتر. نظرًا لأن الامتصاص عند هذا الطول الموجي يعتمد خطيًا على عدد المجموعات الأمينية الحرة، فقد كان تفاعل النينهيدرين بمثابة الأساس لتحديدها الكمي عن طريق قياس الألوان أو قياس الطيف الضوئي. يستخدم هذا التفاعل أيضًا لتحديد المجموعات الأمينية الثانوية (>NH) في الأحماض الأمينية - البرولين والهيدروكسي برولين؛ في هذه الحالة، يتم تشكيل منتج أصفر مشرق. الحساسية - ما يصل إلى 0.01٪. يتم إجراء التحليل الآلي الحديث للأحماض الأمينية من خلال الجمع بين فصل التبادل الأيوني للأحماض الأمينية وتحديدها الكمي باستخدام تفاعل النينهيدرين. عند فصل مخاليط الأحماض الأمينية باستخدام اللوني الورقي، فإنه يجعل من الممكن تحديد كل حمض أميني بكمية لا تقل عن 2-5 ميكروغرام.

يمكن استخدام شدة اللون للحكم على كمية الأحماض الأمينية.

هذا التفاعل إيجابي ليس فقط مع الأحماض الأمينية الحرة، ولكن أيضًا مع الببتيدات والبروتينات وما إلى ذلك.

تفاعل بروتين الزانثوبروتينيسمح باكتشاف الأحماض الأمينية العطرية (فينيل ألانين، تيروزين، هيستيدين، تريبتوفان)، بناءً على تفاعل الاستبدال الإلكتروفيلي في النواة العطرية (نترة).

عندما يعمل حمض النيتريك المركز، على سبيل المثال، على التيروزين، يتم تشكيل منتج أصفر اللون.

رد فعل فول.هذا رد فعل على السيستين والسيستين. أثناء التحلل المائي القلوي، يتم فصل "الكبريت المترابط بشكل فضفاض" في السيستين والسيستين بسهولة تامة، مما يؤدي إلى تكوين كبريتيد الهيدروجين، الذي يتفاعل مع القلويات وينتج كبريتيد الصوديوم أو البوتاسيوم. عند إضافة خلات الرصاص (II)، يتكون راسب رمادي-أسود من كبريتيد الرصاص (II).

وصف التجربة. يُسكب 1 مل من محلول السيستين في أنبوب اختبار، ويُضاف 0.5 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم 20%. يسخن الخليط حتى الغليان، ثم يضاف 0.5 مل من محلول خلات الرصاص الثنائي. لوحظ راسب رمادي-أسود من كبريتيد الرصاص (II):

رد فعل زيمرمان.هذا رد فعل على حمض الجلايسين الأميني.

وصف التجربة. إلى 2 مل من محلول الجلايسين 0.1%، المعدل بإضافة محلول قلوي 10% إلى الرقم الهيدروجيني = 8، أضف 0.5 مل من المحلول المائي لثنائي ديهيد الفثاليك. يبدأ خليط التفاعل بالتحول ببطء إلى اللون الأخضر الفاتح. بعد بضع دقائق، يظهر راسب أخضر.

رد فعل على التربتوفان.يتفاعل التربتوفان في بيئة حمضية مع الألدهيدات ويشكل منتجات تكثيف ملونة. على سبيل المثال، مع حمض الجلايوكسيليك (وهو خليط من حمض الأسيتيك المركز)، يتم التفاعل وفقًا للمعادلة:

يتم تفاعل التريبتوفان مع الفورمالديهايد وفقًا لمخطط مماثل.

رد فعل ساكاجوتشي.يعتمد هذا التفاعل على الحمض الأميني أرجينين على تفاعل الأرجينين مع ألفا نافثول في وجود عامل مؤكسد. ولم يتم بعد توضيح آليتها بشكل كامل. ويبدو أن التفاعل يتم وفق المعادلة التالية:

نظرًا لأن مشتقات الكينونيمينات (في هذه الحالة، النفثوكوينون)، التي يتم فيها استبدال هيدروجين مجموعة الإيمينو -NH- بجذر ألكيل أو أريل، تكون دائمًا ملونة باللون الأصفر والأحمر، إذن، على ما يبدو، اللون البرتقالي الأحمر للمركب. يتم تفسير الحل أثناء تفاعل ساكاجوتشي من خلال ظهور مشتق إيمين النفثوكوينون. ومع ذلك، لا يمكن استبعاد إمكانية تكوين مركب أكثر تعقيدًا بسبب مزيد من الأكسدة لمجموعات NH المتبقية من بقايا الأرجينين وحلقة البنزين من α-naphthol:

وصف التجربة. يُسكب 2 مل من محلول أرجينين 0.01% في أنبوب اختبار، ثم يُضاف 2 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم 10% وبضع قطرات من محلول كحول 0.2% من ألفا نافثول. يتم خلط محتويات أنبوب الاختبار جيدًا، وإضافة 0.5 مل من محلول الهيبوبروميت وخلطها مرة أخرى. أضف على الفور 1 مل من محلول اليوريا 40٪ لتثبيت اللون البرتقالي والأحمر الذي يتطور بسرعة.

رد فعل بيوريت– يستخدم كرد فعل لوني للبروتينات. وفي البيئة القلوية بوجود أملاح النحاس الثنائي فإنها تعطي اللون البنفسجي. يرجع اللون إلى تكوين مركب النحاس (II) بسبب مجموعة الببتيد -CO-NH-، وهي خاصية البروتينات. حصل هذا التفاعل على اسمه من مشتق اليوريا - البيوريت، الذي يتشكل عند تسخين اليوريا مع إزالة الأمونيا:

بالإضافة إلى البروتينات والبيوريت، يتم إعطاء نفس اللون من قبل المركبات الأخرى التي تحتوي على هذه المجموعة: الأميدات، إيميدات الأحماض الكربوكسيلية، وكذلك المركبات التي تحتوي على المجموعات -CS-NH- أو =CH-NH- في الجزيء. تتفاعل أيضًا البروتينات وبعض الأحماض الأمينية والببتيدات والبيوريت والببتونات المتوسطة.

يختلف لون المركب الناتج عن تفاعل البيوريت مع الببتيدات المختلفة إلى حد ما ويعتمد على طول سلسلة الببتيد. تشكل الببتيدات التي يبلغ طول سلسلة مكونة من أربعة بقايا من الأحماض الأمينية وما فوق مركبًا أحمر اللون وثلاثي الببتيدات - أرجواني وثنائي الببتيدات - أزرق.

الشكل الكيتوني للبولي ببتيد

شكل انول من البولي ببتيد

عندما يتفاعل البولي ببتيد مع النحاس (OH) 2، يتم تشكيل مجمع، ويمكن إظهار هيكله على النحو التالي.

طرق تحديد الأحماض الأمينية

تعتبر الأحماض الأمينية من المواد النشطة بيولوجياً، فهي تلعب دوراً مهماً في حياة جسم الإنسان؛ وبعضها ضروري ويدخل الجسم مع الطعام. يوجد حاليًا عدد من الطرق للتقدير الكمي للأحماض الأمينية في المواد النباتية الطبية وفي الأدوية والسوائل البيولوجية وفي المنتجات الغذائية.

من بين مجموعة متنوعة من طرق التحديد الكمي للأحماض الأمينية في كائنات مختلفة، يمكن تمييز أربع مجموعات رئيسية: طرق التحليل الكروماتوغرافي والطيف الضوئي والمعايرة والكهروكيميائية.

الطرق الكروماتوغرافية

على مدى العقود الماضية، تم إحراز تقدم كبير في مجال التحليل اللوني للغاز والسائل للأحماض الأمينية. تم اقتراح طريقة تستخدم الأعمدة المعبأة، والتي تسمح بالفصل شبه الكامل لـ 17 من الأحماض الأمينية المهمة بيولوجيًا في وقت قصير نسبيًا.

تم تطوير طريقة لتقدير الأحماض الأمينية باستخدام كروماتوجرافيا الغاز والسائل في عينات المصل والبلازما والبول والسائل النخاعي، تعتمد على تحضير إيثرات 2،3،4،5،6-بنتافلوروبنزويل-أيزوبيوتيل متبوعة بالفصل. على عمود ثنائي ميثيل سيلوكسان في وضع برمجة درجة الحرارة من 140 درجة مئوية إلى 250 درجة مئوية مع كاشف تأين اللهب. زمن الفصل الكروماتوغرافي هو 28 دقيقة. ونتيجة البحث تم فصل 27 حمض أميني.

على الرغم من تنوع طرق التحليل اللوني السائل عالي الأداء لتحليل الأحماض الأمينية، فإن الطريقة الأكثر سرعة وسهولة في الوصول إليها هي نسخة الطور العكسي مع الكشف الطيفي. من أجل الفصل والكشف الناجح، يتم تحويل الأحماض الأمينية إلى مشتقات كارهة للماء وممتصة للضوء، أي يتم إجراء اشتقاق ما قبل العمود. يتم استخدام ألدهيد أورثوفثاليك، والنفثالين -2،3-ثنائي كربوكسي ألدهيد، و9-فلورينيل ميثيل كلوروفورمات ككواشف اشتقاق.

تم تطوير طريقة للتقدير الكمي لـ L-cystine وL-glutamic acid والجليسين في عقار "Eltacin" الذي له نشاط مضاد للأكسدة مع تأثير مضاد للذبحة الصدرية. تم تحديد حمض الجلوتاميك والجليسين عن طريق تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء في المرحلة العكسية بعد اشتقاق العمود المسبق باستخدام كاشف orthophthalicdehyde / N-acetyl-L-cysteine. إن اشتقاق السيستين، وفقًا للمؤلفين، أمر صعب بسبب عدم استقرار الحمض الأميني نفسه والمشتقات الناتجة. ولذلك، تم إجراء تحليل السيستين عن طريق المعايرة البروماتولوجية. وقد وجد أن وجود كميات كبيرة من السيستين في العينة لا يتعارض مع تحديد منتجات اشتقاق الجليسين وحمض الجلوتاميك مع كاشف ألدهيد أورثوفثاليك / N-أسيتيل-L-سيستين. تتميز الطريقة بتكرار نتائج عالية ودقة التحديد.

تم دراسة إمكانية استخدام 4,7-فينانثرولين-5,6-ديون (فانكوينون) ككاشف توسيم فلوروجيني لتكوين العمود المسبق لمشتقاته لغرض الفصل والتحليل الكمي للأحماض الأمينية بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء. التحقيق. نظرًا لعدم وجود مضان جوهري، يتفاعل الفانكينون مع المجموعات الأمينية من الأحماض الأمينية (عند 68 درجة مئوية لمدة 160 دقيقة)، مكونًا إيمينوكوينول، الذي يتم قياس مضانه عند طول موجة يبلغ 460 نانومتر. تم التعرف على المشتقات المعزولة بواسطة أطياف Tm وIR والكتلة وPMR. تم إجراء تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء على كروماتوجرافيا باستخدام كاشف الفلورسنت وعمود مع شطف متدرج مع مخاليط: محلول ثلاثي إيثيل أمين - محلول فوسفات (درجة الحموضة 3) - ميثانول. تم استخدام الكينيدين كمعيار داخلي. تعتبر هذه الطريقة واعدة جدًا في المختبرات الكبيرة ويمكن اقتراحها لتحليل الأحماض الأمينية في أشكال الجرعات النهائية.

تم تطوير تقنية كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء مع جهاز استشعار حيوي لقياس الجهد من أجل التحديد الكمي لليسين. يتم إنشاء جهاز الاستشعار البيولوجي عن طريق ربط غشاء يحتوي على أوكسيديز ليسين بقطب كهربائي NH4 + انتقائي للأيونات. تم الكشف عن أيونات الأمونيوم المتولدة أثناء التحلل الأنزيمي لليسين عن طريق قياس الجهد. تم تطوير طريقة سريعة لقياس الكثافة اللونية لتحليل التربتوفان في سوائل الاستنبات. تم إجراء كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة على ألواح Sorbfil. تم إجراء التحليل اللوني في نظام بروبانول -2 - 25% محلول هيدروكسيد الأمونيوم (7:3) لمدة 25 دقيقة. تم تجفيف الكروماتوجرام في درجة حرارة الغرفة وحفظه عند 120 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. للكشف عن البقع على اللوني، تم استخدام كاشف محدد - 4-ثنائي ميثيل أمينوبنزالدهيد، انتقائي لحلقة الإندول من التربتوفان، في شكل محلول إيثانول 0.5٪ مع إضافة 5٪ حمض الكبريتيك المركز. بعد تطوير المخططات اللونية عن طريق الغمر في كفيت تفلون بمحلول محضر حديثًا من 4-ديميثيل أمينوبنزالدهيد، تم الاحتفاظ بها لمدة 5-7 دقائق عند درجة حرارة 110 درجة مئوية. تم إجراء مسح لبقع التربتوفان بطول موجة 625 نانومتر باستخدام مقياس كثافة الفيديو بالكمبيوتر. الطريقة المطورة رغم دقتها العالية في التحديد والإنتاجية إلا أنها خاصة بالتربتوفان.

لتحليل الأحماض الأمينية β في السوائل البيولوجية والأدوية والمنتجات الغذائية، يتم استخدام أساليب الرحلان الكهربائي الشعري على نطاق واسع، بناءً على فصل مكونات خليط معقد في شعري كوارتز تحت تأثير مجال كهربائي مطبق. نظرًا لأن الأحماض الأمينية ذات طبيعة زويتيريونية، فيمكن فصلها باستخدام محاليل عازلة إلكتروليتية ذات قيمة pH مناسبة، وغالبًا ما يتم استخدام مخازن فصل محايدة وأساسية.

من أجل زيادة خصوصية وحساسية طريقة الرحلان الكهربائي الشعري لتحليل الأحماض الأمينية β الفردية، يتم استخدام اشتقاقها الأولي، يليه الفصل في الشعيرات الدموية الكوارتز وتحديد القياس الطيفي لمنتجات التفاعل. وبالتالي، يتم استخدام 9-فلورينيل ميثيل فورمات، 9-(2-كاربازول)-إيثيل كلوروفورمات، وصبغة السيانين كعوامل مشتقة. تعود آفاق هذه الطريقة إلى مزايا مثل التحليل السريع، وسهولة إعداد العينات، وانخفاض استهلاك الكواشف، وبساطة الأجهزة.

المعدات والكاشف: ورقة اللوني. غرفة اللوني مقياس الألوان الكهروضوئي مقص؛ ألواح زجاجية (3'32 سم) - 3 قطع؛ حامل اللوني. خزانة التجفيف ماصات دقيقة. أنابيب اختبار ذات سدادات أرضية؛ سحاحة 25 مل؛ خليط قياسي من الأحماض الأمينية. خليط اختبار من الأحماض الأمينية. البيوتانول، حمض الخليك، الماء بنسبة 15:3:7؛ 1% محلول نينهيدرين في 95% أسيتون؛ كحول إيثيلي (75%) مشبع بكبريتات النحاس.

إنجاز المهمة

خذ ورقة كروماتوغرافية بقياس 18 × 28 سم وارسم خطًا أفقيًا بقلم رصاص بسيط على مسافة 3 سم من حافتها القصيرة. ثم يتم تقسيمها إلى أقسام غير متساوية وفقًا للرسم البياني المرفق ويتم تحديد حدود تطبيق الخلطات القياسية والاختبارية بالسهام ويتم عمل النقوش المقابلة بقلم رصاص بسيط.

يتم تقوية الورقة فوق سطح الطاولة ويتم تطبيق الخليط القياسي أولاً على خط البداية، مقيدًا بالأسهم، باستخدام ماصة دقيقة خاصة في خط رفيع حتى يتم نقل المحلول بالكامل من الماصة الدقيقة إلى خط البداية (يتم نقل الماصة الدقيقة إلى خط البداية). مليئة إلى 2-3 سم). يتم قياس كتلة المحلول المطبق عن طريق وزن الماصة المملوءة بالخليط القياسي (قبل تطبيق المحلول) والفارغة (بعد تطبيق المحلول). عادة ما يتم تطبيق 0.02-0.03 جم من المحلول القياسي على الورق. ثم تملأ ماصة نظيفة بخليط اختبار الأحماض الأمينية (الذي يصدره المعلم للدراسة) ويزنها ويوضع الخليط على خط البداية بالعلامة المناسبة.

يتم وضع اللوني المحضر في غرفة كروماتوغرافية مع نظام مذيب تم سكبه مسبقًا لفصل خليط من الأحماض الأمينية، على سبيل المثال، خليط من البيوتانول وحمض الأسيتيك والماء بنسبة 15:3:7. ويتم الفصل بالكروماتوغرافيا التصاعدية حتى يصل الخط الأمامي بمقدار 2-3 سم إلى الحافة العلوية للورقة الكروماتوغرافية (خط النهاية). بعد ذلك، تتم إزالة المخطط اللوني من الحجرة ويتم إدخال الطرف العلوي من الورقة على الفور في حامل مصنوع من ثلاثة قضبان زجاجية مثبتة بحلقة مطاطية وتوضع في غطاء دخان لمدة 20 دقيقة لإزالة المذيبات من الورقة.

أرز. 8. مخطط ترتيب الأحماض الأمينية على اللوني:

أ - نقطة تطبيق خليط من الأحماض الأمينية. أنا - السيستين والسيستين.

2 - ليسين. 3 - الهستيدين. 4 - أرجينين. 5 - حمض الأسبارتيك،

سلسلة وجليسين. 6 - حمض الجلوتاميك والثريونين. 7 - ألانين.

8 - برولين. 9 - التيروزين. 10 - فالين وميثيونين. الثاني - التربتوفان.

12 - فينيل ألانين. 13- الليوسين والأيسولوسين

يتم غمس اللوني المجفف في محلول 1% من النينهيدرين في الأسيتون للكشف عن موضع بقع الأحماض الأمينية عليه. يتم بعد ذلك وضع المخطط اللوني في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق لإزالة الأسيتون ونقله إلى خزانة التجفيف، حيث يُترك لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية. يتم الكشف عن الأحماض الأمينية للمخاليط القياسية والاختبارية على شكل بقع زرقاء بنفسجية تقع في سلسلة في اتجاه حركة نظام المذيبات من خط البداية إلى الحافة العلوية للكروماتوجرام.

يتم تحديد الأحماض الأمينية الموجودة في خليط الاختبار عن طريق المصادفة في الرسم اللوني للمواقع التي تشغلها الأحماض الأمينية في المخاليط القياسية ومخاليط الاختبار (الشكل 8).

لتحديد المحتوى الكمي للأحماض الأمينية في مخاليط الاختبار، يتم رسم المخطط اللوني بقلم رصاص بسيط بحيث يتم احتواء المناطق الملونة الواقعة على نفس المستوى، المقابلة لنفس الحمض الأميني، داخل مستطيلات متطابقة تقريبًا (الشكل 9) .

أنا الثاني الثالث الرابع

أرز. 9. تخطيط الأحماض الأمينية على اللوني:

أنا - الخليط رقم أنا؛ الثاني - الخليط رقم 2؛ 1U - الخليط رقم 3؛ Ш - قياسي

خليط الأحماض الأمينية

يتم قطع المساحات المحددة من الورق ووضعها في أنابيب اختبار، ويجب أن يتوافق عددها مع عدد البقع الموجودة على المخطط اللوني. يُسكب 10 مل من محلول 75٪ من الكحول الإيثيلي المشبع بكبريتات العسل من السحاحة في كل أنبوب اختبار (يضاف 0.2 مل من محلول مشبع من كبريتات النحاس إلى 500 مل من الكحول الإيثيلي). يتم تغطية أنبوب الاختبار، ومع التحريك من حين لآخر، يتم نقل اللون الأحمر القرميدي (ملح النحاس الأزرق البنفسجي Ruemann) بالكامل من الورق إلى المحلول. يستغرق هذا 15-20 دقيقة. يتم قياس الامتصاص (الكثافة البصرية) للمحاليل القياسية والاختبارية باستخدام مسعر كهروضوئي مزود بمرشح الضوء الأخضر (540 نانومتر). يتم تركيب كفيت بمحلول 75% من الكحول الإيثيلي مع كبريتات النحاس في التدفق المرجعي.

يتم حساب المحتوى الكمي للأحماض الأمينية في محلول الاختبار من نسبة انقراضات الاختبار والعينات القياسية.

مثال للحساب. لنفترض أن الخليط القياسي يحتوي على 1.8 ملغ من الجليسين في 1 مل، ويتم تطبيق 0.02 جم من هذا المحلول القياسي على شريط البداية. ولذلك، تلقى اللوني (1.8 × 0.02) = 0.036 ملغ من الجليكاين. ولنتفق أيضًا على أن امتصاص المحاليل الملونة كان 0.288 للمعياري و0.336 للخليط المجهول. بعد ذلك، سيكون محتوى الجليسين في الخليط قيد الدراسة، المرسوم على المخطط اللوني، (36´0.336): 0.288=42 ميكروغرام. إذا افترضنا أيضًا أنه تم تطبيق خليط الاختبار على اللوني بكمية، على سبيل المثال، 0.0250 جم، فإن محتوى الجليسين في 1 مل من محلول الاختبار سيكون (42:0.0250) = 1680 ميكروجرام، أو 1.68 مجم/ مل.

اعرض نتائج تجربتك الخاصة واستخلص منها النتائج.

العمل المختبري رقم 15

فصل الأيوناتالحديد 3+ , شركة 2+ , ني 2+

والبروتينات

من المعروف أن جميع الأنواع العشرين من أحماض ألفا الأمينية الأساسية لها نفس البنية، مع ثلاثة أنواع مختلفة من المجموعات الوظيفية (الشكل 3.3). لسوء الحظ، ردود الفعل على مجموعات الأمينو والكربوكسي ليست محددة للغاية، لأن وبالتالي فهي مميزة لجميع الأمينات وعدد من الأميدات والأحماض الكربوكسيلية. وينطبق الشيء نفسه على معظم جذورها = R، 10 منها غير قطبية، أي ممثلة بالمجموعات الأليفاتية = الهيدروكربونية، ومعظمها خاملة كيميائيا. خصوصية معظم الأحماض الأمينية القطبية R، التي تحتوي على الكحول (Ser، Tre، Tyr)، الأميد (Asn، Gln) ومجموعات الكربوكسي (Asp، Glu)، منخفضة نسبيًا أيضًا. المجموعة الأمينية (Lys) والإيميدازول His ومجموعة الجوانيدين Arg أكثر نشاطًا، ونشاط مجموعة الثيو Cys هو الحد الأقصى. لذلك، فإن تفاعل النينهيدرين العالمي، الخاص بالوجود المتزامن لكل من المجموعات الأمينية والكربوكسيية في ذرة α-C، قد تلقى أكبر أهمية عملية في التحليل النوعي والكمي للأحماض الأمينية α، بما في ذلك في محللات الأحماض الأمينية.

أرز. 3.3. الصيغ العامة لتركيب الأحماض الأمينية ألفا وناتج بلمرتها. التوضيحات في النص.

تحتفظ بلمرة الأحماض الأمينية ألفا في بنية الببتيدات والبروتينات (الشكل 3.3) بجميع أنواعها R، ولكن:

1. يصبح تفاعل النينهيدرين سلبيا، لأن باستثناء طرفي N وC، يتم إنفاق مجموعات α-amino وα-carboxy على تكوين روابط الببتيد. يشير تفاعل النينهيدرين الإيجابي مع البروتين على الأرجح إلى وجود شوائب من الأحماض الأمينية في المستحضر أو ​​الحاوية.

2. بالنسبة لجميع الببتيدات والبروتينات، يكون تفاعل البيوريت خاصًا بمجموعة الببتيد الغائبة في الأحماض الأمينية الأحادية.

3. من بين التفاعلات الأكثر تحديدًا للأحماض الأمينية R، ما يلي مفيد: تفاعل بروتين الزانثوبروتين مع حمض النيتريك المركز، إلى R العطري Fen، Tyr، Tri؛ التفاعل مع الإيزاتين على الحلقة Pro ذات الأعضاء الخماسية، بالإضافة إلى التفاعلات على الإيميدازول R His ومجموعة الثيو Cys ومجموعة الجوانيدينو Arg. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن بعضًا من هذه الـ R مخفية داخل كريات البروتين وبالتالي تضعف التفاعلات النوعية معها. لذلك، قبل تنفيذها، عادة ما يتم تغيير طبيعة البروتينات بطريقة أو بأخرى.

4. على عكس المحاليل الحقيقية للأحماض الأمينية، تتميز المحاليل الغروية للبروتينات ردود الفعل الرسوبية، المرتبطة بتدمير قشورها المائية، ونتيجة لذلك، انخفاض قابليتها للذوبان تحت تأثير عوامل إزالة الماء: الأملاح المحايدة = التمليح، الميثانول = MeOH، الإيثانول = EtOH، الأسيتون، اليوريا وعوامل أخرى.

عند إجراء ردود الفعل النوعية، يجب عليك:

1. اتبع قواعد السلامة من الحرائق بعناية واعمل مع الأحماض والقلويات المركزة = EZh.

2. ضع علامة على صفين من أنابيب الاختبار باستخدام رسم بياني زجاجي أو قلم فلوماستر ووضع ما لا يزيد عن 0.5 مل (2-5 قطرات) من محلول حمض أميني 1% في أحدهما، وتقريبًا نفس الحجم من 1. محلول البروتين٪ في الآخر.

3. في زوج من أنابيب الاختبار التي تحتوي على محاليل الأحماض الأمينية والبروتينات، أضف 3-5 قطرات من الكواشف المقابلة بالتوازي وقم بتنفيذ الإجراءات المتبقية المشار إليها للتفاعل المقابل.

4. إذا كان من الضروري تسخين أنابيب الاختبار، قم بإزالة غطاء البوتقة وأشعل الوقود الجاف بعود ثقاب. ثم قم بتثبيت أنبوب الاختبار في حامل، التصميم البدائي الذي لا يمكن الاعتماد عليه على الإطلاق. لذلك، من الأفضل لف اثنين من أنابيب الاختبار بقطعة من الورق مطوية في شريط، وإمساكهما بإبهامك، وتمرير النصفين السفليين من أنابيب الاختبار بالتساوي عبر اللهب، تجنب توجيه الرقاب إلى الجيران والتسبب في غليان المحلول بعنف. بعد الانتهاء من العملية، قم بإطفاء اللهب على الفور باستخدام غطاء البوتقة.

5. يتم إعداد نتائج التجارب طبقاً للنموذج على انتشار الدفتر المختبريعلى شكل جدول:

6. بعد النظر في النتائج التي تم الحصول عليها، وبعد إكمال البروتوكول، مع مجموعة من أنابيب الاختبار، قم بتقديمها إلى المعلم لحمايتها.

1. تفاعل النينهيدرين.بناءً على تمييع ونزع الكربوكسيل للأحماض الأمينية ألفا بمحلول كحولي من النينهيدرين:

تشكل الأمونيا الناتجة، التي تتفاعل مع جزيئين من النينهيدرين، مشتقًا ملونًا بحد أقصى للامتصاص عند 540 نانومتر (لـ Pro - 440 نانومتر).

تقدم العمل: تضاف 3-5 قطرات من محلول كحول النينهيدرين 0.5% إلى عينات الاختبار. قم بتسخين أنابيب الاختبار برفق مع الخلطات على اللهب وبعد 2-3 دقائق قم بتسجيل ظهور اللون.

2. تفاعل بروتين الزانثوبروتين.كما ذكر أعلاه، فإنه يقوم على تكوين مشتقات نيترو من الأحماض الأمينية ذات R العطرية: Fen، Tyr، Tri.

تقدم العمل: عند تشغيل غطاء الدخان، أضف بعناية بضع قطرات من حمض النيتريك المركز (HNO 3) إلى زوج من أنابيب الاختبار مع محاليل الاختبار. قم بتسخين أنابيب الاختبار بلطف على اللهب، وتجنب توجيه أعناقها نحو الجيران، وتسجيل تطور اللون.

3. تفاعل النيتروبروسيد.وهو يعتمد على التحلل المائي القلوي للحمض الأميني السيستين المحتوي على الكبريت، مع إطلاق كبريتيد الصوديوم (Na 2 S)، الذي يعطي مركبًا أحمر مع محلول طازج من نيتروبروسيد الصوديوم.

تقدم العمل:أضف كمية متساوية من هيدروكسيد الصوديوم 20% إلى كلا الأنبوبين مع 5-10 قطرات من محلول الاختبار وقم بغليهما لمدة 3-5 دقائق على الأقل. أضف 3-5 قطرات من محلول نيتروبروسيد الصوديوم إلى أنابيب الاختبار وسجل تطور اللون.

4. تفاعل البيوريت.يعتمد على تكوين مركب ملون من رابطة الببتيد مع أيون Cu 2+ في بيئة قلوية. بمثابة اختبار عالمي لتحديد الببتيدات والبروتينات في المحاليل. نظرًا لزيادة عدد الروابط الببتيدية، تزداد شدة لون المحلول خطيًا، لذلك يتم استخدامه على نطاق واسع لتحديد القياس الضوئي لتركيزات البروتين.

تقدم العمل. أضف نفس الكمية من محلول هيدروكسيد الصوديوم 10% إلى أنابيب الاختبار مع 5-10 قطرات من محلول الاختبار. اخلط جيدًا وأضف قطرتين من محلول كبريتات النحاس 1% (CuSO 4). امزج العينات وسجل تطور الألوان بعد بضع دقائق.

5. اختبار الغليان.على أساس تمسخ البروتينات الحرارية.

تقدم العمل. قم بتحميض كلا أنبوبي الاختبار باستخدام محاليل الاختبار بما لا يزيد عن قطرة واحدة من محلول حمض الأسيتيك 1% (AcOH) ثم قم بتسخينهما حتى الغليان. بعد غليان المحاليل لمدة 2-3 دقائق، سجل النتائج واشرح آلية الظاهرة.

6. الترسيب بأملاح المعادن الثقيلة(مه) . تعتمد خصائص تغيير طبيعة هذه العناصر على قدرة كاتيونات Me الثقيلة على التفاعل مع المجموعات الوظيفية R لجزيء البروتين: ثيو، أمينو، كربوكسي، عطري. كما أن أنيوناتها القوية تسبب إعادة شحن المجموعات الأيونية في جزيئات البروتين، وبالتالي تدمير الروابط الأيونية فيها.

تقدم العمل. أضف بضع قطرات من محلول كبريتات النحاس 5% (CuSO 4) إلى كلا الأنبوبين اللذين يحتويان على محاليل الاختبار. تسجيل وشرح النتائج التي تم الحصول عليها.

7. الترسيب بالأحماض العضوية.يعتمد على تمسخ البروتينات الحمضية وتكوين المشتقات التساهمية للمجموعات الثيوية والأمينية والعطرية من الأحماض الأمينية R مع الكلور العضوي.

تقدم العمل. أضف بضع قطرات من محلول 10% من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) إلى أنابيب الاختبار مع محاليل الاختبار، وبعد بضع دقائق، قم بتسجيل النتائج