Методические рекомендации по изучению теоретического материала по курсу «Частная медицинская вирусология. Определение показаний для бактериологического, вирусологического, серологического исследований при расшифровке этиологии оки и оценка результатов Лаб

Архив сайтов Internet Archive Wayback Machine Очень часто нападение черных пиарщиков происходит неожиданно для вас. В таком случае вы впервые сталкиваетесь с необходимостью пристального изучения противника. В случае если вы даже предполагали подобное развитие событий (например, в

4.9. Резервное копирование с помощью Time Machine

4.9. Резервное копирование с помощью Time Machine Операционная система Mac OS X Leopard позволяет выполнять регулярное резервное копирование данных на вашем компьютере с помощью приложения Time Machine (Машина времени). После соответствующих настроек приложение автоматически будет

4.9.2. Создание первой резервной копии с помощью Time Machine

4.9.2. Создание первой резервной копии с помощью Time Machine Прежде чем перейти к созданию первой резервной копии, следует вставить внешний диск или иметь свободный раздел жесткого диска, отведенный только для резервного копирования.При подключении внешнего диска размером,

4.9.4. Использование Time Machine

4.9.4. Использование Time Machine Когда необходимые настройки Time Machine выполнены и создано некоторое количество резервных копий, можно приступить к поиску и восстановлению ранних версий файлов. Для этого:1. Откройте окно Finder и выделите файл, необходимый для восстановления.2. Если

Вирусологические исследования в клинике инфекционных болезней приобретают все большее значение, что в первую очередь обусловлено ростом удельного веса инфекций вирусной природы, клиника которых не всегда типична. В то же время быстрые и надежные методы вирусологической диагностики разработаны не для всех инфекционных болезней, многие из них трудоемки, для их проведения нужны специальные условия, экспериментальные животные, питательные среды и подготовленный персонал. В настоящее время для диагностики вирусных инфекций используют 3 основных вида исследования.
1. Микроскопическое исследование заразного материала с целью выявления вирусного антигена или патогномоничных изменений в тканях. В диагностических целях прямое микроскопическое исследование инфекционного материала от больных используется при ограниченном числе вирусных инфекций (бешенстве, ветряной оспе, желтой лихорадке, герпесе и др.). Более широкое применение получил метод, основанный на обнаружении вирусного антигена с помощью флуоресцирующих антител. Метод иммунофлуоресценции может быть достоверным лишь при четком выполнении всех технических требований.
2. Вирусологические методы.
3. Серологические исследования для определения прироста титра антител в динамике болезни. Серологические методы исследования более доступны в лабораторных условиях.
Для этих исследований необходимо взятие сыворотки крови в острый период болезни и в период реконвалесценции (парные сыворотки). Пробы крови для серологических исследований берутся стерильно без антикоагулянтов и консервантов.
Основными этапами вирусологических исследований являются выделение вирусов, их идентификация, характеристика основных биологических свойств. Для выделения различных групп вирусов в настоящее время не существует единой методики. Это в первую очередь обусловлено многообразием их свойств и особенностями культивирования вне организма хозяина. Для исследования используют биосубстраты (смывы со слизистых оболочек, кровь и ее компоненты, спинномозговая жидкость, моча и испражнения, биоптаты органов и тканей или их кусочки, взятые при аутопсии), которые подвергают специальной обработке с последующим пассированием материала. Взятый для исследования материал должен храниться при температуре от -20 °С до -70 °С. В зависимости от предварительного диагноза обработка материала имеет свои особенности, но во всех случаях предполагается получение субстрата, максимально очищенного от примесей слизи, клеток органов и тканей или их фрагментов, бактерий. Это достигается гомогенизацией исследуемого материала в специальном аппарате или растиранием в фарфоровой ступке на холоде с кварцевым стеклом (кусочки органов и тканей) с добавлением стерильного охлажденного (+4 С) 0,9 %

раствора хлорида натрия до получения 10-30 % суспензии и последующим центрифугированием при 1500-3000 об/мин в течение 10-15 мин. Полученную таким образом надосадочную жидкость используют для проведения дальнейших исследований.
До интенсивного развития и внедрения в широкую практику метода культуры тканей и клеток применялось заражение экспериментальных животных или эмбрионов курицы. Эти методы применяются и в настоящее время. Выявление вирусов с использованием животных наиболее целесообразно в тех случаях, когда удается воспроизвести в эксперименте типичную картину инфекционного заболевания или отдельные его проявления. Так, возбудители группы арбовирусов и Коксаки могут быть выявлены при заражении в мозг мышей-сосунков, гриппа - при заражении куриных эмбрионов или интраназальном введении исследуемого материала мышам. В вирусологических лабораториях в последние годы наиболее широко стали применять метод культуры клеток и тканей, позволяющий выделять аденовирусы, герпес-вирусы, респираторно-синцитиальный вирус, миксовирусы и другие и уже на первых этапах исследования осуществлять этиологическую диагностику заболевания. Основанием для этого являются хорошо изученные цитологические особенности взаимодействия большинства вирусов и клеток. Так, заражение клеток HeLa, Нер-2 материалом, содержащим аденовирус 2-го типа, уже на 3-й сутки приводит к изменению характера роста клеточного монослоя и к появлению типичных клеток в виде виноградных гроздьев и т. д., хорошо определяемых в обычном световом микроскопе при малом увеличении.
Исключительное значение для этиологической диагностики инфекционного заболевания имеет стандартизация выделения вируса из исследуемого материала, что на данном этапе работы предполагает использование генетически чистых линейных животных с учетом их фенотипических (в первую очередь возрастных) особенностей. Это обусловлено прежде всего тем, что экспериментальные животные различных генетических линий и возраста в разной степени восприимчивы к вирусам. Так, при интрацеребральном заражении мышей нейротропным штаммом WSN вируса гриппа у животных линий BALB/c, A, CBA и беспородных чувствительность оказалась наибольшей, такая же закономерность установлена и в случаях интраназального введения исследуемого материала. Существенное значение для конечных результатов работы по выделению вирусов имеет предварительное обследование животных, куриных эмбрионов, культур клеток и тканей на предмет латентного вирусоносительства. Весьма широко используемые в лабораторной практике куриные эмбрионы могут быть заражены вирусами лейкоза птиц, птичьего энцефаломиелита, инфекционного синусита, пситтакоза, болезни Ньюкасла, возбудителями некоторых бактериальных инфекций (паратифы и др.), а также микоплазмой. Еще большее число бактериальных и особенно вирусных агентов способно спонтанно заражать культуру клеток и тканей и переживать в них. Их присутствие существенно влияет на оценку исследуемого материала. Некоторые виды микоплазм в культуре клеток
могут обусловливать гемагглютинацию и гемадсорбцию и даже образовывать под агаровым покрытием бляшки, сходные с образуемыми вирусами. Немаловажное значение имеет также загрязнение клеточных культур одного типа другими, наиболее часто это бывает связано с клетками HeLa и наблюдается при работе с различными типами культур в одной комнате, при плохой обработке лабораторной посуды и др. Наличие контаминации клеточных культур или заражение животных бактериальными агентами, как правило, проявляется достаточно четко (изменение характера роста монослоя клеток, свойств культуральной среды, гибель куриных эмбрионов или животных с определенной симптоматикой и т. д.) и особых затруднений при оценке результатов не представляет. Сложнее обстоит вопрос с латентными формами инфекции, где требуется применение серологических и других методов. Эти указания должны учитываться в работе врача-вирусолога, особенно при проведении этиологической диагностики неясных случаев заболевания.

Вирусологические методы исследования широко применяются в медицине для диагностики множества инфекционных и некоторых онкологических заболеваний, имеющих вирусную природу.

Вирусологические методы исследования используются также с целью идентификации , изучения их биологии и способности воздействовать на клетки животных и человека, что в дальнейшем помогает понимать патогенез вирусных заболеваний и правильно выбирать методы их лечения. Кроме установления этиологии заболевания и мониторинга эффективности терапии, вирусологические методы исследования имеют большое значение в определении и проведении противоэпидемических мероприятий.

Прямые методы исследования в вирусологии

Прямые вирусологические методы исследования позволяют обнаружить вирус, вирусную нуклеиновую кислоту или вирусный антиген непосредственно в клиническом материале и являются, таким образом, наиболее быстрыми (экспресс-методы – до 24 ч). Данные методы менее информативны и требуют лабораторного подтверждения непрямыми методами диагностики в связи с нередким получением ложноотрицательных или ложноположительных результатов. К прямым относятся следующие методы исследования:

• электронная микроскопия с окрашиванием вирусов методом негативного контрастирования (позволяет определить наличие вируса и его концентрацию в материале при условии, что в 1 мл содержится не менее 105 вирусных частиц);
• иммунная электронная микроскопия, основанная на взаимодействии специфических антител с вирусами с образованием комплексов, которые легче обнаруживаются при негативном контрастировании, нежели вирусы отдельно;
• твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием меченных ферментами антител, которые связываются с антигенами, образуя комплексы, выявляемые при добавлении субстрата для использованного фермента;
• реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – прямая или непрямая – основана на применении антител, связанных с флюоресцентным красителем;
• радиоиммунный анализ (РИА) основан на использовании меченных радиоизотопами антител и гамма-счётчиков;
• цитологические методы основаны на микроскопическом исследовании окрашенных мазков, биоптатов, материалов аутопсии;
• молекулярные методы – молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот и полимеразная цепная реакция (первая основана на выявлении комплементарных нитей нуклеиновых кислот с помощью метки, вторая – на принципе репликации вирусспецифической последовательности ДНК в три этапа).

Существует три варианта молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот – точечная гибридизация, блот-гибридизация (используется для диагностики ВИЧ инфекции) и гибридизация in situ (непосредственно в инфицированных клетках). ПЦР (полимеразная цепная реакция) на сегодняшний день всё шире применяется в мониторинге и диагностике вирусных инфекций в связи с высокой чувствительностью и специфичностью данного метода.

Непрямые вирусологические методы исследования

Данные методы основаны на выделении и идентификации вируса. Это более трудоёмкие и длительные методики, однако, более точные. Материалом для таких исследований может быть содержимое везикул, соскобы (при ветряной оспе, герпетическом поражении кожи и слизистых оболочек), носоглоточный смыв (при респираторных инфекциях), кровь и ликвор (при арбовирусных инфекциях), фекалии (при энтеровирусных инфекциях), смывы (при кори, краснухе и др.). В связи с тем, что вирусы способны размножаться только в живых клетках, культивирование вируса осуществляют в культуре ткани, курином эмбрионе или в организме животного (хомяка, белой мыши, собаки, кошки, некоторых видов обезьян). Индикацию вируса проводят по цитопатическому действию, в реакции гемадсорбции, по цветной пробе, по результатам реакции торможения гемагглютинации, по изменениям или их отсутствию в куриных эмбрионах или культурах ткани, по выживаемости чувствительных животных.

Серологические методы диагностики, применяемые в вирусологии

Под серологической подразумеваются вирусологические методы исследования, основанные на реакции антиген-антитело. При этом чаще всего используются парные сыворотки крови, которые берутся с интервалом в несколько недель. При нарастании титра антител в 4 и более раз реакция считается положительной. Для определения типоспецифичности вирусов применяется реакция вируснейтрализации, с целью определения группоспецифичности – реакция связывания комплемента. Также широко применяются реакции пассивной гемагглютинации, торможения гемагглютинации, обратной пассивной гемагглютинации, РИФ и различные варианты иммуноферментного анализа.

Сравнительно недавно в ходе генно-инженерных исследований разработана методика получения моноклональных антител. Узкая специфичность моноклонов преодолевается применением нескольких моноклональных антител к разным вирусным детерминантам. Это повысило чувствительность и специфичность вирусологических методов исследования с определением вирусных антигенов. В настоящее время создано множество различных тест-систем для иммунологической диагностики вирусных инфекций.

Вирусологи ческие ме тоды иссле дования — методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл .

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3—5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- m -антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования ): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М.БЕРБЕКОВА

_________________________________________________________________

ОСОБЕННОСТИ РНК-ВИРУСНЫХ И ДНК-ВИРУСНЫХ

ИНФЕКЦИЙ
Методические рекомендации по изучению теоретического материала

по курсу «Частная медицинская вирусология»

для иностранных студентов
Для специальности 060101 – Лечебное дело

Нальчик - 2010

ББК 52.63я73

Рецензент:

кандидат биологических наук старший преподаватель кафедры микробиологии, гигиены и санитарии Кабардино-Балкарской государственной

сельскохозяйственной академии

М.Х. Пежева

Составитель: Блиева Лариса Заурбековна

Особенности РНК-вирусных и ДНК-вирусных инфекций: Методические рекомендации по изучению теоретического материала по курсу «Частная медицинская вирусология» для иностранных студентов - Нальчик: Каб.-Балк. ун-т,2010.- 48 с.

В методических рекомендациях представлены цели и задачи каждой темы, теоретические сведения по частной вирусологии, требования к уровню подготовленности студентов. К каждой теме даются контрольные вопросы, ситуационные задачи и список рекомендуемой литературы. Работа содержит глоссарий основных понятий и определений по частной вирусологии.

Издание предназначено для иностранных студентов, обучающихся на 3 курсе по специальности «Лечебное дело».

УДК 576.858(075.8)

ББК 52.63я73

государственный университет, 2010

Курс «Частная медицинская вирусология» преподаётся студентам 3 курса медицинского факультета и является составной частью дисциплины «Микробиология, вирусология, иммунология». Общий объём аудиторных часов по дисциплине составляет 184. На медицинскую вирусологию отводится 11 часов, из которых 2 часа на лекции и по 3 часа на 3 лабораторных занятия. Настоящие методические рекомендации разработаны по темам соответствующим лабораторным работам. Существующий лабораторный практикум не содержит весь необходимый материал для усвоения данных тем.

Иностранным студентам сложно осваивать большой объём информации за 3 лабораторных занятия. Автор счёл целесообразным изложить в данном издании краткое описание возбудителей вирусных инфекций и патогенезы, вызываемых ими заболеваний.

К каждой теме даётся перечень контрольных вопросов; ситуационные задачи, которые позволят студентам оценить свою подготовленность по пройденной теме; список рекомендуемой литературы.

Справочная часть издания содержит характеристику основных понятий и терминов применяемых в современной вирусологии и схемы строения самых распространённых вирусов. Алфавитный порядок изложения терминологического словаря-справочника удобен для пользования.
ТЕМА 1. РНК-содержащие вирусы

Цель – изучение особенностей строения РНК-содержащих вирусов и патогенеза, вызываемых ими заболеваний.

Задачи :

1 – знать систематическое положение каждого возбудителя;

2 – знать морфологию и структуру возбудителей;

3 – изучить патогенез всех заболеваний, вызываемых данными возбудителями по плану: а) источник инфекции; б) способы заражения; в) входные ворота инфекции; г) стадии патогенеза;

4 – знать методы лабораторной диагностики заболевания;

5 – знать специфическую профилактику и специфическую терапию;

6 – уметь проводить дифференциацию между различными вирусами;

7 – владеть решением ситуационных задач по теме;

8 – владеть составлением ситуационных задач по теме.
Характеристика РНК-вирусов

Занятие 1

Семейство Orthomyxoviridae (от греч. orthos – прямой, myxa – слизь)

Род 1 - Influensavirus A, B

Вирус гриппа типа А

Вирус гриппа типа В

Род 2 - Influensavirus C

Вирус гриппа типа С

Особенности патогенеза гриппа

Источник – больной человек, носитель; способ заражения – воздушно-капельный. Инкубационный период – 1-3 дня. Продромальный период – общее недомогание, чувство разбитости. Основные симптомы – быстрое повышение температуры до 37,5-38 0 С с сопутствующими миалгиями , насморком, кашлем, головными болями; продолжительность лихорадочного периода 3-5 суток. Вирус гриппа А – нейротропен, поэтому возможно развитие нейротоксикоза. Развивается катар верхних дыхательных путей (сухой кашель, боли за грудиной, ринит). Возможна геморрагическая пневмония и отёк лёгких, в результате чего быстро наступает смерть. Редко и чаще у детей бывает абдоминальный синдром (боли в животе, тошнота, рвота, диарея).

Лабораторная диагностика

Экспресс-диагностика. Обнаруживают вирусные антигены в исследуемом материале (носоглоточное отделяемое) с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) (прямой и непрямой варианты) и иммуноферментного анализа (ИФА). Можо обнаружить в материале геном вирусов при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Вирусологический метод. Заражают культуры клеток HeLa-2, через сутки при микроскопии обнаруживают мелкоочаговую дегрануляцию в клеточной культуре. Индикацию вирусов проводят и по образованию «бляшек», «цветной пробе», реакции гемагглютинации и реакции гемадсорбции. Идентифицируют вирусы по антигенной структуре. Применяют реакцию связывания комплемента, реакцию торможения гемагглютинации и реакцию биологической нейтрализации вирусов.

Серологический метод. Диагноз ставят при четырёхкратном увеличении титра антител в парных сыворотках от больного, полученных с интервалом в 10-14 дней. При постановке реакции нейтрализации цитопатического эффекта положительный результат отмечают при внесении сыворотки типа А. применяют реакцию торможения гемагглютинации, реакцию связывания комплемента, реакцию иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ. Специфическая профилактика – живая аттенуированная вакцина, убитая вакцина, сплит-вакцины, химическая вакцина. Специфическая терапия – противогриппозный γ-глобулин.

Семейство Paramyxoviridae (от лат. рara – около)

Род 1 – Respirovirus – вирусы парагриппа 1 и 3 типов

Род 2 – Rubulavirus – вирусы эпидемического паротита и парагриппа 2 и 4 типов

Род 3 – Morbilivirus – вирус кори

Род 4 – Pneumovirus – респираторно-синцитиальный вирус (РС-вирус)

Особенности патогенеза парагриппа

Источник – больной человек, носитель; способ заражения – воздушно-капельный. Инкубационный период – 3-6 суток; у взрослых – в форме катаров верхних отделов дыхательных путей (ларингит); у детей – протекает тяжелее, часто с симптомами интоксикации, наиболее часто наблюдают ларинготрахеобронхит с развитием ложного крупа; у детей до года – бронхиолиты с пневмониями.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. От больного берут слизь или смыв из дыхательных путей , мокроту и заражают культуру клеток. Индикацию проводят по цитопатическому действию вирусов, реакции гемагглютинации. Идентификацию осуществляют с помощью реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции нейтрализации.

Серологический метод . Для выявления антигенов вируса и для обнаружения антител в парных сыворотках крови больного проводят реакцию торможения гемагглютинации, реакцию связывания комплемента, реакцию нейтрализации (ретроспективная диагностика). Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.

Особенности патогенеза эпидемического паротита, или «свинки»

Источник – больной человек; способ заражения – воздушно-капельный. Инкубационный период – 14-21 день. Типичная форма заболевания проявляется как одно- или двусторонний паротит, сопровождающийся лихорадкой. Инфицировании околоушных слюнных желёз происходит путём гематогенного распространения вируса, возникающего через 3-5 суток появления первых симптомов. Вирусемия приводит к дессиминированию вируса по всему организму; возможны серозные менингиты, эпидидимоорхиты, как следствие – бесплодие. Иммунитет стойкий.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Исследуемым материалом (слюна, цереброспинальная жидкость, моча, сыворотка крови) заражают культуру клеток куриных фибробластов или куриный эмбрион. Вирус идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации, реакции иммунофлюоресценции, реакции нейтрализации, реакции связывания комплемента.

Серологический метод. В парных сыворотках больного определяют антитела с помощью иммуноферментного анализа, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации. Специфическая диагностика – живая вакцина, ассоциированная вакцина (против кори, паротита, краснухи). Специфическая терапия – отсутствует.

Особенности патогенеза кори

Источник – больной человек (чаще дети 4-5 лет); способы заражения – воздушно-капельный, реже контактный. Инкубационный период – 8-15 дней. Острые респираторные проявления (ринит, фарингит, конъюнктивит, фотофобия, температура 38,8-39 0 С). На 3-4 день на слизистых оболочках и коже появляются пятнисто-папулёзная сыпь: сначала на лице, затем на туловище и конечностях. За сутки до появления сыпи на слизистой оболочке щёк появляются мелкие пятна, окружённые красным ореолом. Заболевание продолжается 7-9 дней, сыпь исчезает, не оставляя следов. Иммунитет пожизненный.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Исследуют смыв из носоглотки, соскобы с элементов сыпи, кровь, мочу. Вирус обнаруживают в патологическом материале и в заражённых культурах клеток с помощью реакции иммунофлюоресценции , реакции торможения гемагглютинации и реакции нейтрализации. Характерно наличие многоядерных клеток и антигенов возбудителя в них.

Серологический метод. Для серологической диагностики применяют реакцию связывания комплемента, реакцию торможения гемагглютинации и реакцию нейтрализации. Специфическая профилактика – живая аттенуированая вакцина. Специфическая терапия – отсутствует.

Особенности патогенеза заболеваний, вызываемых респираторно- синцитиальным вирусом

Источник – больной человек; способы заражения – воздушно-капельный, контактно-бытовой. Возбудитель проникает в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей, размножается, вызывая их гибель, патологический процесс распространяется на нижние дыхательные пути, развивается вторичный иммунодефицит, что приводит к развитию вторичных бактериальных инфекций. Инкубационный период – 3-5 дней. Признаки ОРЗ, затем трахеобронхит, пневмония. Иммунитет непродолжительный, возможны рецидивы.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Исследуемым материалом (отделяемое носоглотки, ткань лёгких) заражают культуры клеток. Индикацию вирусов проводят по характеру цитопатического действия – образованию синцития, а идентификацию вирусов – с помощью реакции нейтрализации, реакции связывания комплемента.

Серологический метод. Обнаружение специфического антигена проводят с помощью реакции иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа (экспресс-диагностика).

Вирусоскопический метод. При микроскопическом (гистологическом) исследовании в эпителии слизистой оболочки бронхов обнаруживают многоядерные клетки и синцитий. Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.

Контрольные вопросы:

1. 
   Вирус гриппа: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
2. 
   Вирус парагриппа: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
3. 
   Вирус паротита: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
4. 
   Вирус кори: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
5. 
   Респираторно-синцитиальный вирус: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.

1. 
   Поступил материал (соскобы с элементов сыпи) от ребёнка с острыми респираторными проявлениями, фотофобией, температурой 38,8-39,0 0 С и пятнисто-папулёзной сыпью на слизистых оболочках и коже. При заражении культур клеток были обнаружены многоядерные клетки. Определите возбудителя.
2. 
   Поступил материал (отделяемое носоглотки) от ребёнка с признаками острого респираторного заболевания. С помощью вирусологического метода произвели индикацию возбудителя. В культуре клеток наблюдалось образование синцития. Определите возбудителя заболевания.

Семейство Picornaviridae

Род 1 – Enterovirus – вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО-вирусы

Особенности патогенеза полиомиелита

Источник – больной человек; способ заражения – фекально-оральный; воздушно-капельный; контактный. Инкубационный период – 7-14 дней. Различают 3 клинические формы полиомиелита: паралитическую, менингеальную, абортивную. Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле. Паралитическую форму чаще вызывает вирус полиомиелита серотипа 1. Иммунитет пожизненный.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Материалом для исследования служат кал, отделяемое носоглотки, при летальных исходах – кусочки головного и спинного мозга, лимфатические узлы. Культуры клеток заражают исследуемым материалом. О репродукции вирусов судят по цитопатическому действию. Идентифицируют (типируют) выделенный вирус с помощью типоспецифических сывороток в реакции нейтрализации в культуре клеток.

Серологический метод. Серодиагностика основана на использовании парных сывороток больных с применением эталонных штаммов вируса в качестве диагностикума. Содержание сывороточных иммуноглобулинов классов IgG, IgA, IgM определяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Специфическая профилактика – массовая иммунизация детей пероральной живой вакциной из 3-х серотипов. Специфическая терапия – отсутствует.

Особенности патогенеза заболеваний, вызываемых вирусами Коксаки

Источник – больной человек; способ заражения – фекально-оральный, контактный. Инфекции часто наблюдают у детей. Обычно отмечают симптомы простуды или лихорадку неясного генеза. В редких случаях развиваются тяжёлые поражения – пузырчатка полости рта и конечностей, эпидемическая плевродиния, перикардиты и миокардиты. Острые кишечные вирусные заболевания вызывают только вирусы группы А.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Материалом для исследования являются испражнения, отделяемое носоглотки. Заражают культуры клеток HeLa или почек обезьян (Коксаки В, отдельные серотипы Коксаки А) или мышей сосунков. Учитывают характер патологических изменений у заражённых мышей. Вирусы идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе. Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.

Особенности патогенеза заболеваний, вызываемых ЕСНО-вирусами

Источник – больной человек; способ заражения – фекально-оральный, воздушно-капельный. Вирусы вызывают простудные инфекционные заболевания, асептические менингиты, протекающие относительно легко, реже восходящие параличи и энцефалиты, лихорадочное состояние, сопровождающееся кореподобными высыпаниями.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Вирус выделяют из цереброспинальной жидкости, испражнений, отделяемого носоглотки. Заражают культуры клеток почек обезьян и идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе.

Серологический метод. В сыворотке крови выявляют нарастание титра антител, используя реакцию торможения гемагглютинации, реакцию связывания комплемента, реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ. Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.
Семейство Togaviridae

Род 1 – Rubivirus – вирус краснухи

Особенности патогенеза краснухи

Источник – больной человек, носитель; способы заражения – воздушно-капельный, трансплацентарный. Различают 2 формы болезни: 1 – приобретённая. Инкубационный период – 11-24 дня. Заболевание начинается с незначительного повышения температуры и лёгких катаральных симптомов, конъюнктивита, а также увеличения заднешейных и затылочных лимфатических узлов. В последующем появляется пятнисто-папулёзная сыпь по всему телу. Иммунитет стойкий.

2 – врождённая – медленная вирусная инфекция, развивающаяся в результате внутриутробного трансплацентарного заражения плода. Заболевание характеризуется развитием катаракты, глухоты и пороков сердца, а также других аномалий развития. Слепота в сочетании с глухотой и поражением ЦНС приводит к умственной отсталости. Иммунитет нескойкий.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Выделяют вирус из смывов со слизистой оболочки носа и зева, крови, мочи, реже – испражнений, а также внутренних органов погибших детей. Заражают исследуемым материалом чувствительные клетки, индикацию вирусов осуществляют на основании интерференции с цитопатогенными вирусами или по обнаружению цитопатического действия.

Серологический метод. Для обнаружения антител применяют реакцию нейтрализации, реакцию связывания комплемента, реакцию торможения гемагглютинации, иммуноферментный анализ. Диагностическое значение имеет четырёхкратное и более увеличение титров антител в динамике заболевания, а также определение специфических IgM, свидетельствующих о недавно перенесённом заболевании или болезни в момент обследования. Специфическая профилактика – живая вакцина, ассоциированная вакцина. Специфическая терапия – отсутствует.

Семейство Rhabdoviridae

Род 1 – Lessavirus – вирус бешенства

Особенности патогенеза бешенства

Источники – дикое бешенство – лисы, волки, грызуны, летучие мыши, городское бешенство – собаки, кошки; способы заражения – контактный при укусах, реже – при обильном ослюнении повреждённых покровов, возможен аэрогенный в пещерах населённых летучими мышами, иногда алиментарный. Вирус, попав со слюной больного животного в повреждённые наружные покровы, реплицируется и персистирует в месте внедрения. Затем распространяется по аксонам периферических нервов, достигает клеток головного и спинного мозга, где размножается. В цитоплазме нейронов мозга обнаруживаются тельца Бабеша-Негри. Клетки претерпевают дегенеративные изменения. Размножившись вирус попадает из мозга по центробежным нейронам в различные ткани, в том числе в слюнные железы. Инкубационный период от 10 дней до 3 месяцев, иногда до года. В начале заболевания – недомогание, страх, беспокойство, бессонница, затем развиваются рефлекторная возбудимость, спазматические сокращения мышц глотки и гортани. Судороги усиливаются при попытке пить, при виде льющейся воды, от яркого света, шума. Развиваются галлюцинации, а в конце болезни – параличи мышц конечностей и дыхания. Реже болезнь развивается без возбуждения и водобоязни; развивается паралич и слюнотечение. Летальность – 95%. Постинфекционный иммунитет не изучен.

Лабораторная диагностика

Вирусоскопический метод. Постмортальная диагностика включает обнаружение телец Бабеша-Негри в мазках отпечатках или срезах из ткани мозга. Тельца Бабеша-Негри выявляют методами окраски по Романовскому-Гимзе, Манну, Туревичу, Муромцеву и др.

Вирусологический метод. Патологический материал интрацеребрально вводят белым мышам. Идентификацию вирусов проводят с помощью иммуноферментного анализа, а также реакции нейтрализации на мышах, используя для нейтрализации вируса антирабический иммуноглобулин.

Серологический метод. Определяют антитела у больных с помощью реакции связывания комплемента, иммуноферментного анализа. Специфическая профилактика и терапия – инактивированная вакцина Ферми, генно-инженерная вакцина. Иммунизируют людей укушенных подозрительными на бешенство животными. При этом активный иммунитет формируется во время инкубационного периода. При множественных укусах создают пассивный иммунитет введением антирабического иммуноглобулина.

Семейство Retroviridae

Род 1 – Lentivirus - ВИЧ

Особенности патогенеза ВИЧ-инфекции

Источник – больной человек, носитель; способы заражения – половой, парентеральный, трансплацентарный. Стадии ВИЧ-инфекции:

1 – инкубационный период – 2-4 недели;

2 – стадия первичных проявлений: острая лихорадка, лимфоденопатия, диарея, завершается стадия бессимптомной фазой, восстановлением самочувствия, может продолжаться годами;

3 – стадия вторичных заболеваний, проявляющихся поражением дыхательной, нервной систем, желудочно-кишечного тракта, возникновением злокачественных опухолей в различных сочетаниях;

4 – стадия – собственно СПИД, характеризуется кахексией, упорной диареей, адинамией, анемией, деменцией, снижением всех иммунных показателей с летальным исходом.

Лабораторная диагностика

Серологический метод. Для подтверждения диагноза определяют антитела к белкам gp41, gp120, gp160, р24 у ВИЧ-1 и антитела к белкам gp36, gp105, gp140 у ВИЧ-2. ВИЧ-антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ-инфекции и при СПИДе. При любой положительной пробе для подтверждения результатов ставится реакция иммуноблоттинга. Применяют также ПЦР. Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.

Контрольные вопросы:

1. 
   Вирус полиомиелита: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
2. 
   Вирус Коксаки: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
3. 
   ЕСНО-вирус: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
4. 
   Вирус краснухи: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
5. 
   Вирус бешенства: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
6. 
   Вирус иммунодефицита человека: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.

1. 
   Поступил материал для исследования (смыв со слизистой оболочки носа и зева) от ребёнка с лёгкими катаральными симптомами и увеличенными заднешейными и затылочными лимфатическими узлами. Произвели заражение культуры клеток, в которых после инкубации обнаружили ЦПД. Определите возбудителя.
2. 
   Поступил материал для исследования (испражнения) от ребёнка с признаками общего недомогания , головной болью, повышенной температурой. Произвели посев в культуру клеток, в которых после инкубации были обнаружены вирусные частицы устойчивые к эфиру. Определите возбудителя.

Литература

1. 
   Большой словарь медицинских терминов / Сост. Федотов В.Д. – М.: ЗАО Центрполиграф, 2007.
2. 
   Воробьёв А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник. – М.: МИА, 2004.
3. 
   Воробьёв А.А., Быков А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – М.: МИА, 2003.
4. 
   Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология. – М.: АСАDEMA, 2003.
5. 
   Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник.
6. 
   Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь-справочник./ - 2-е изд., доп. и перераб. – Мн.: «Асар», 1999.
7. 
   Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для мед. вузов. – 3-е изд., испр. и доп. – СПб.: СпецЛит, 2002.
8. 
   Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / Под ред. А.А. Воробьёва – М.: Медицинское информационное агентство, 2004.
9. 
   Общая медицинская вирусология / Н.С. Горячкина и др.; под ред. Н.С. Горячкиной, Л.И. Кафарской. – Ростов н/Д: Феникс, 2007.
10. 
    www. infections.ru/rus/all/mvb journals .shtml