Практическое занятие №2.

Тема: Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Цель: Изучить методы выделения чистых культур бактерий и овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.

Вопросы для самоподготовки:

1.Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.

2Правила оформления направления на бактериологическое исследование.

3.Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

4.Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.

Основные понятия темы.

Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.

Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы . Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

фамилия, имя, отчество, возраст пациента; предполагаемый диагноз заболевания; предшествующая антимикробная терапия; характер материала; дата и время взятия материала; цель исследования; название лечебного учреждения, номер отделения, палаты; подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):

Выделение чистой культуры возбудисуток); Идентификация чистой культуры (1-3 суток).

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение , свойств и структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.

Самостоятельная работа студентов на занятии.

Работа 1

Цель: Освоить бактериологический метод диагностики.

Задача. В бактериологическую лабораторию поступил исследуемый материал (испражнения) от больного с предварительным диагнозом: «Пищевая токсикоинфекция?». При микроскопии материала обнаружены грамположительные кокки и грамотрицательные палочки.

Выделите чистые культуры микроорганизмов, проведите их идентификацию. Определите этиологию пищевой токсикоинфекции.

Методика:

Все этапы бактериологического метода условно осуществляются в течение одного занятия: студент выполняет манипуляции очередного этапа, относит материал в термостат и сразу получает готовый результат для выполнения следующего этапа исследования.

1. Посев исследуемого материала на агар в чашке Петри методом механического разобщения с целью получения отдельных колоний (1-ый день).

Простерилизованной в пламени горелки и охлажденной петлей берут материал для посева и вносят в чашку, слегка приоткрыв крышку. На поверхности питательной среды материал распределяют петлей следующим образом: у края чашки частыми штрихами образуют овальную площадку, на которой остается значительная часть материала, затем проводят параллельные штрихи на расстоянии 0,5 см от одного края чащики к другому. При посеве петлю следует держать параллельно агару, чтобы не царапать его (рис.2.2.а). После рассева петлю вынимают из чашки и немедленно обжигают в пламени, одновременно закрывая чашку Петри крышкой. Чашку маркируют и помещают вверх дном в термостат на сутки.

2.Изучение культуральных свойств выросших колоний (2-ой день).

Через сутки при правильном посеве на последних штрихах вырастают отдельные колонии (рис.2.2.б). Дифференцируют разные типы колоний по величине, цвету (Рис. 2.3.а), форме, прозрачности, характеру поверхности (гладкая, шероховатая) и края (ровный, зазубренный) (рис.2.3.б). Из материала части колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Остаток изучаемой колонии отсевают петлей в пробирку на скошенный питательный агар для получения чистой культуры. Посев ставят в термостат на сутки.

3. Идентификация выделенной чистой культуры (3-ий день).

Через сутки выросшую чистую культуру идентифицируют по основным видовым признакам. Изучают морфологию при микроскопии мазка из чистой культуры. Осуществляют посев чистой культуры на тест-системы (стафитест, энтеротест) для изучения активности. Для этого готовят 1-миллиардную взвесь бактерий в физиологическом растворе, затем дозаторными или пастеровскими пипетками вносят 0,1 мл взвеси в лунки тест-системы. Планшет относят в термостат на сутки.

4. Определение вида выделенных микроорганизмов (4-ый день).

Через 24 часа оценивают результаты биохимической активности по изменению цвета индикатора в лунке и сопоставляют их с таблицами тест-системы. По результатам изучения свойств выделенных чистых культур определяют виды микроорганизмов, что является одной из конечных целей бактериологического метода диагностики. Используют определитель Берджи.

Результат оформляют в виде протокола исследования.

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию (разведение с изотоническим раствором NaCl и т.п.)

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

· морфология и тинкториальные свойства

· культуральные свойства (характер роста на питательных средах)

· биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов, гликолитическая, протеолитическая и др. активность)

· серологические свойства (антигенные)

· вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)

· патогенность для животных

· фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)

· чувствительность к антибиотикам

· другие индивидуальные свойства

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.

При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводиться в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.

Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 12). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 12. Схема изучения колоний

№	Признак	Возможные характеристики колоний
1.	Форма	Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая
2.	Величина, мм	Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм)
3.	Характер поверхности	Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая
4.	Цвет	Бесцветные, окрашенные в … цвет
5.	Прозрачность	Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные
6.	Характер краев	Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые
7.	Внутренняя структура	Гомогенная, зернистая, неоднородная
8.	Консистенция	Вязкая, слизистая, крошковидная
9.	Эмульгирование в капле воды	Хорошо, плохо

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа или под лупой.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина вмолекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных иконечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.

Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°С на сутки.

Заключение

Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

5. Основные формы бактерий

6. Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний

7. Простые и сложные методы окраски

8. Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену

III. План практической работы

IV. Примеры ситуационных задач

Тема 2: Специальные методы окраски. Устройство биологического микроскопа. Виды

I. Вопросы для самоподготовки:

II. Базовый текст

1. Специальные методы окраски для выявления отдельных структур бактерий

2. Методы окраски отдельных групп про- и эукариот

3. Изучение подвижности микроорганизмов

4. Виды микроскопии

5. Устройство биологического микроскопа

6. Порядок проведения иммерсионной микроскопии

III. План практической работы

IV. Примеры ситуационных задач

Тема 3: Морфология и ультраструктура отдельных групп микроорганизмов: риккетсий, хламидий, микоплазм, актиномицет, спирохет, грибов, простейших

I. Вопросы для самоподготовки:

II. Базовый текст

III. План практической работы

IV. Примеры ситуационных задач

Теоретические вопросы для рубежного контроля знаний

Перечень практических навыков

Модуль ιι «Физиология микроорганизмов»

I. Вопросы для самоподготовки:

II. Базовый текст

1. Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

2. Классификация питательных сред

3. Понятия асептики и антисептики

4. Понятие дезинфекции, методы дезинфекции и контроль эффективности дезинфекции

5. Понятие стерилизации, методы, аппаратура и режимы стерилизации

6. Методы определения эффективности стерилизации

7. Понятие о виде, штамме, колонии, чистой культуре микроорганизмов

8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний

10. Техника посева микроорганизмов

11. Особенности культивирования анаэробных бактерий

III. План практической работы

IV. Примеры ситуационных задач

Диагностике инфекционных заболеваний.

I этап.

II этап. Цель: накопление чистой культуры

III этап. Цель: идентификация исследуемой культуры

IV этап.

Тема 2: Физиология бактерий. Питание, дыхание, размножение, метаболизм и ферментные системы бактерий. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний (2-й день).

I. Вопросы для самоподготовки:

II. Базовый текст

1. Метаболизм микроорганизмов

2. Ферментные системы микроорганизмов

4. Механизмы питания бактерий

6. Классификация бактерий по типу дыхания - биологического окисления.

7. Брожение и его виды

8. Условия культивирования бактерий

9. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий

10. Бактериологический метод исследования. Проведение 2 этапа бактериологического метода выделения аэробов. Культуральные свойства бактерий.

III. План практической работы

4. Заполнить таблицу « Классификация микроорганизмов по типам дыхания»

IV. Примеры ситуационных задач

Тема 3: Идентификация чистых культур. Биохимическая активность бактерий. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний (3-день).

1. Проведение III этапа бактериологического метода выделения чистых культур микроорганизмов. Схема идентификации микроорганизмов

2. Определение чистоты выделенной культуры

3. Использование ферментативной активности бактерий для идентификации микроорганизмов

4. Методы определения гликолитической активности микроорганизмов

5. Методы определения протеолитической активности бактерий

6. Определение окислительно-восстановительных ферментов бактерий

7. Системы для биохимической идентификации бактерий

III. План практической работы

IV. Примеры ситуационных задач

Модуль III «Основы антибактериальной химиотерапии»

2. Механизмы действия антибиотиков на микроорганизмы

3. Побочное действие антибиотиков

4. Механизмы антибиотикорезистентности микроорганизмов

5. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

III. План практической работы

IV. Примеры ситуационных задач

III модуль «Инфекция и инфекционный процесс»

Тема 2: Инфекционный процесс. Факторы патогенности бактерий. Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний

Базовый текст

1. Учение об инфекции. Понятия «инфекция» и «инфекционное заболевание»

3. Классификации инфекционных заболеваний и форм инфекций

4. Периоды и исходы инфекционного заболевания

5. Патогенность и вирулентность, единицы вирулентности

6. Основные факторы патогенности микроорганизмов

7. Микробные токсины

8. Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний

III. План практической работы

IV. Примеры ситуационных задач

III модуль «Экология микроорганизмов. Основы санитарной микробиологии»

Тема 3:Микрофлора организма человека. Санитарно-бактериологическое исследование воды, воздуха, почвы

I. Вопросы для самоподготовки:

II.Базовый текст

2. Функции нормальной микрофлоры организма человека

3. Методы определения микрофлоры организма человека

4. Определение понятия дисбактериоз и причины его возникновения

5. Принципы диагностики и лечения дисбактериоза

6. Предмет санитарной микробиологии и требования, предъявляемые к санитарно-показательным микроорганизмам

7. Микрофлора воды, воздуха и почвы

8. Методы определения санитарно-показательных микроорганизмов воды, воздуха и почвы

III. План практической работы

IV. Примеры ситуационных задач

Теоретические вопросы для рубежного контроля знаний

Перечень практических навыков

Литература

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний

Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

морфология и тинкториальные свойства

культуральные свойства (характер роста на питательных средах)

биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)

серологические свойства (антигенные)

вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)

патогенность для животных

фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)

чувствительность к антибиотикам

другие индивидуальные свойства

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.

При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.

Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 11. Схема изучения колоний

		Возможные характеристики колоний
		Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая
	Величина, мм	Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм)
	Характер поверхности	Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая
		Бесцветные, окрашенные
	Прозрачность	Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные
	Характер краев	Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые
	Внутренняя структура	Гомогенная, зернистая, неоднородная
	Консистенция	Вязкая, слизистая, крошковидная
	Эмульгирование в капле воды	Хорошо, плохо

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.

Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.

Заключение

Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

"

Культуральный метод исследования представляет собой выделение из питательной среды бактерий определённого вида путём культивирования, с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей.

Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой. После окончательной идентификации их характеристик, бактерии, выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.

1 этап

А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение и транспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости от свойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.

Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.

В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.

Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.

Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.

Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.

2 этап

А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности. Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.

Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре (для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).

Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера. Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:

· 0,1% глюкозы;

· 1% лактозы;

· Специальный реактив на сероводород;

· Феноловый красный индикатор.

3 этап

А)Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.

Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.

Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).

В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.

Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.

E. coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.

S. paratyphi – способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.

S. paratyphi A- не продуцирует сероводород.

S. paratyphi B – сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).

S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.

Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.

Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.

В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.

Диагностика инфекционных заболеваний необходима для последующего проведения адекватной этиотропной терапии, направленной на уничтожение возбудителя патологического процесса. Выявление и идентификация патогенных микроорганизмов проводится при помощи различных методик лабораторной диагностики, одним из которых является бактериологическое исследование.

Бактериология как наука получила развитие в XIX веке благодаря внедрению бактериологических методик исследования.

Принцип и суть методики

Основной целью бактериологического исследования является выявление и последующая идентификация патогенного (болезнетворного) микроорганизма в исследуемом материале. Для этого проводится посев на специальные питательные среды (мясо-пептонный бульон, плотная среда агар), на котором при наличии возбудителя в материале через некоторое время вырастают колонии микроорганизмов. Их идентифицируют по микроскопическим (размер клеток, их форма, определенный цвет при окрашивании по Граму), биохимическим (способность расщеплять некоторые углеводы или
белки) и антигенным (взаимодействие с антителами к основным классам возбудителя) свойствам. В целом на проведение данной методики диагностики требуется от 48 до 72 часов, что достаточно долго (особенно при необходимости быстрого начала этиотропной терапии инфекционной патологии). Тем не менее данный вид лабораторной диагностики не теряет своей актуальности на сегодняшний день, так как является достоверным для большого количества инфекционных заболеваний.

Очень часто во время бактериологического исследования дополнительно проводится определение чувствительности выделенного патогенного микроорганизма к основным группам современных антибиотиков. Это дает возможность в последующем подобрать наиболее эффективную этиотропную терапию.

Когда проводится бактериологическая диагностика

Показанием к проведению бактериального исследования служит диагностика различных инфекционных заболеваний, к которым относятся:

Также данная методика может проводится для определения возбудителя гнойных процессов различной локализации. В первую очередь это необходимо для определения чувствительности выявленных микроорганизмов к антибиотикам, так как при развитии гнойного процесса возбудители часто являются устойчивыми к большинству антибиотиков.

Диагностика дисбактериоза при помощи бактериологического исследования дает возможность определить вид условно-патогенных микроорганизмов, а также их количество, на основании чего делается заключение о выраженности нарушения нормальной микрофлоры.

Материалом при бактериологическом исследовании служит моча, кровь, мазки из полости носа, уретры, влагалища, прямой кишки, кал, сперма у мужчин, мокрота. Выбор материала зависит от показаний к проведению данного метода лабораторной диагностики и локализации патологического процесса.

Расшифровка результатов

В большинстве случаев результат исследования основывается на 2-х показателях - факт наличия выявляемого
микроорганизма (положительный или отрицательный результат), а также количество бактериальных клеток на единицу объема исследуемого материала (данный показатель имеет место только при положительном результате). Численность бактерий выражается в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ). Чем выше данный показатель, тем большее количество бактерий в исследуемом материале. Также результат может включать показатели чувствительности выявленного микроорганизма к антибиотикам. Он обычно состоит из списка основных классов антибактериальных средств (