Как проводится скрининг на муковисцидоз у новорожденных. Что такое скрининг новорожденных, как и когда его проводят. Специальные условия, необходимые для ребенка
Диссертация
Кусова, Залина Ахсаровна
Ученая cтепень:
Кандидат медицинских наук
Место защиты диссертации:
Код cпециальности ВАК:
Специальность:
Генетика
Количество cтраниц:
1.1. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.
1.2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.
1.3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
1.4. ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. ПАТОГЕНЕЗ.
2.2. КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА МУКОВИСЦИДОЗА.
2.2.1. БРОНХОЛЕГОЧНАЯ СИСТЕМА.
2.2.2. ПИЩЕВАРИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА.
2.2.3. СИНДРОМ ПСЕВДО-БАРТТЕРА У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ.
2.2.4. ОЦЕНКА ФИЗИЧЕСКОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ.
2.3.ГЕН СБТЯ.
2.3.1. МУТАЦИИ В ГЕНЕ СРТЯ. КЛАССИФИКАЦИЯ.
2.3.2. ГЕНОТИП-ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ КОРРЕЛЯЦИЯ У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ.
2.4. НЕОНАТАЛЬНЫЙ СКРИНИНГ НА МУКОВИСЦИДОЗ .
2.5.РАСЧЕТЫ ОТНОСИТЕЛЬНОГО РИСКА МВ У НОВОРОЖДЕННЫХ С
ГИП ЕРТРИПСИНОГЕНЕМИЕЙ.
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ.
3.1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ ВЫСОКОГО РИСКА МВ.
3.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.2.1. ОЦЕНКА ДОСТОВЕРНОСТИ ПРОТОКОЛА СКРИНИНГА ИРТ/ИРТ, ПОТОВЫЙ ТЕСТ.
3.2.2. ОБЩЕКЛИНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
3.2.3.СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗА.
3.2.3.1 ИССЛЕДОВАНИЕ СЕКРЕТА ПОТОВЫХ ЖЕЛЕЗ.
3.2.3.2. ИЗУЧЕНИЕ ВНЕШНЕСЕКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.
3.2.3.3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ИССЛЕДОВАНИЕ МОКРОТЫ.
3.2.4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
3.2.4.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК.
3.2.4.2.ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ.
3.2.4.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ СБТИ.
3.2.4.4. РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ.
3.2.4.5. МЕТОД ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.
3.2.5. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА.
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОГРАММЫ НЕОНАТАЛЬНОГО СКРИНИНГА НА МВ.
4.2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА КЛИНИЧЕСКОГО СТАТУСА В ДВУХ ГРУППАХ ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ.
4.3.1. АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ СРТЯ У НОВОРОЖДЕННЫХ С ГИПЕРТРИПСИНОГЕНЕМИЕЙ НА ПЕРВОМ ЭТАПЕ СКРИНИНГА.
4.3.2. РАСЧЕТ ОТНОСИТЕЛЬНОГО РИСКА МУКОВИСЦИДОЗА У НОВОРОЖДЕННЫХ С ГИПЕРТРИПСИНОГЕНЕМИЕЙ (ИРТ I, ИРТ II).
Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Эффективность программы массового обследования новорожденных на муковисцидоз"
1.1Актуальность проблемы.
Муковисцидоз (MB) (Cystic Fibrosis) - наиболее частая наследственная аутосомно-рецессивная патология, частота которой в европейских странах составляет примерно 1 на 3000 новорожденных, причем, в зависимости от географической зоны и этнической принадлежности населения, отмечаются значительные колебания этой величины. В популяциях Российской Федерации (РФ) частота MB варьирует от 1:4900 до 1:12000 [Петрова Н.В., Гинтер Е.К., 1997., Капранов Н.И. и др, 2006], и, по крайней мере, каждый пятидесятый является гетерозиготным носителем мутации в гене CFTR. Многие годы MB относили к разряду «летальных » заболеваний, так как в среднем продолжительность жизни« больных не превышала 5 лет. Сегодня, благодаря разработке и успешному внедрению эффективных методов обследования новорожденных на MB в первые недели жизни, заболевание диагностируется значительно раньше, а средняя продолжительность и качество жизни больных растет.
В мире скрининг новорожденных на* MB успешно проводится более тридцати лет. Зарубежными исследователями за это время накоплен достаточный опыт и сформулированы основные принципы, касающиеся выбора тактики обследования новорожденных, оптимизации методов профилактического и этиопатогенетического лечения, описаны первые убедительные данные эффективности скрининга. На сегодняшний день, объектом пристального внимания многих исследователей стала разработка программ скрининга, выявляющих как можно большее число пациентов с минимальным количеством ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
В России массовое обследование новорожденных на MB проводится не так. давно - с июня 2006 года, как часть национального приоритетного б проекта «Здоровье ». С учетом системы финансирования и принципов организации медицинской помощи в нашей стране, наиболее оптимальным признан протокол скрининга ИРТ/ИРТ, лотовый тест. Ключевым этапом скрининга, как и большинства схем, является определение уровня» иммунореактивного трипсиногена (ИРТ ) в крови новорожденных на первой неделе жизни. Неонатальная гипертрипсиногенемия в популяции обнаруживается с частотой 1 на 100-200 здоровых новорожденных. По мнению ряда авторов, повышение уровня иммунореактивного трипсиногена при MB, происходит в результате закупорки протоков панкреатических желез вязким секретом, что препятствует проникновению трипсиногена в просвет тонкого кишечника, где он в норме превращается в трипсин. Это приводит к выбросу трипсиногена в кровь . Кроме того, причиной! повышения уровня ИРТ в. крови-новорожденных, помимо MB, может быть ряд врожденных и наследственных патологий, таких как: внутриутробная гипоксия плода, внутриутробные инфекции, перинатальный стресс, незрелость плода, коньюгационная желтуха новорожденных, хромосомные перестройки и др., а также гетерозиготное носительство мутаций в гене CFTR, как следствие функциональной1 недостаточности поджелудочной" железы . Доля ложноотрицательных показателей скрининга с использованием различных схем, не превышает 3%, а граница между ложноположительными и ложноотрицательными результатами, составляет менее 10% (данные по европейским странам). По России такие данные отсутствуют.
В настоящее время в московском центре MB наблюдается свыше шестидесяти детей с диагнозом MB выявленных по программе неонатального скрининга за период с июня 2006 года по декабрь 2010 года.
Как. показал многолетний опыт зарубежных исследователей, активное диспансерное наблюдение вновь выявленных больных, своевременное начало комплексного лечения, позволяют предотвратить или, по крайней 7 мере, замедлить развитие осложнений, ведущих к ранней инвалидизации. Подтверждением этому является рост числа больных взрослого возраста, произошедший в мире за последние десятилетия .
Кроме того, введение в практику здравоохранения пресимптоматической диагностики MB, создает необходимость консультации врача - генетика, на каждом из этапов скрининга, а, следовательно, и расчета риска заболевания для положительно тестированных младенцев и их родственников [Петрова Н.В.2003.]. При оценке генетического риска MB задача сводится к идентификации и вероятностной оценке наличия дискретного генотипа у консультирующихся. Вопросы, в первую очередь интересующие родителей, связаны с корректностью постановки диагноза и прогнозом заболевания. При этом для проведения расчетов априорных и условных вероятностей необходимо учитывать частоту MB, гетерозиготного носительства мутантных аллелей гена CFTR, долю выявляемых при ДНК - диагностике, мутаций, и относительные частоты мутаций MB в регионах и этнических группах, к которым принадлежат родители1 ребенка. Известно, что данные показатели широко варьируют у разных этносов и в разных популяциях, а рассчитанные на их основе вероятности могут повлиять на репродуктивное поведение консультирующихся [Петрова Н.В.2003.]. В расчетах риска необходимо использовать данные по частоте пораженных, носителей и не носителей мутаций в гене CFTR, для конкретной этнической группы, если таковые имеются. По российским популяциям такие данные отсутствуют.
С учетом всего вышесказанного были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.
1.2.Цель и задачи исследования.
Целью данного исследования является оценка эффективности программы массового обследования новорожденных на МВ в России, на примере г. Москвы.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Оценить достоверность метода двукратного определения концентрации иммунореактивного трипсиногена в плазме крови новорожденных (ИРТ/ИРТ), выбранного в качестве диагностического теста неонатального скрининга на МВ в РФ.
2. Сравнить протокол скрининга ИРТ/ИРТ со схемой ИРТ/ДНК, используемой при обследовании новорожденных на МВ в большинстве зарубежных стран.
3. Оценить клиническую эффективность неонатального скрининга на примере сравнения тяжести течения МВ у больных, выявленных по скринингу, и диагностированных по симптомам заболевания.
4. Изучить частоту мутаций в гене СГТЯ (СЕТЯс1е1е2,3(21кЬ), Р5(Ше1, Ш507, 1677с1е1ТА, 21841тА, 2143с1е1Т, 2183АА>в, 2184с1е1А, 394с1е1ТТ, 382Ые1Т, Ы38тя) в выборке новорожденных с высоким уровнем ИРТ после первого этапа неонатального скрининга.
Заключение диссертации по теме "Генетика", Кусова, Залина Ахсаровна
1. Оценка эффективности программы неонатального скрининга на муковисцидоз показала, что протокол скрининга ИРТ/ИРТ обладает высокой чувствительностью, не менее 96,77%, и специфичностью не менее 99,82%. Доля ложноположительных результатов скрининга составляет 0,00178 (1:558), величина ложноотрицательных результатов после каждого из двух последовательно проведенных этапов не превышает 3% (0,03). Отношение правдоподобия положительного результата теста (+РУ) равно 537:1. Положительная предсказательная ценность (+РУ) метода ИРТ/ИРТ составляет 0,00332.
2. Показано, что метод двукратного определения ИРТ в крови новорожденных соответствует критериям достоверности, но уступает протоколу ИРТ/ДНК по чувствительности (96,77% против 100%); большей вероятности ложноположительных (0,00178 против 0,000344) и ложноотрицательных показателей (0,03 против 0). Несмотря на это, является оправданным для использования в РФ с экономической точки зрения.
3. Определены особенности клинической картины МВ у больных, выявленных по неонатальному скринингу. По сравнению с больными, диагностированными по симптомам заболевания, для них, в большей мере, характерно хорошее самочувствие с оценкой по шкале Швахмана-Брасфильда более 70 баллов. К трем годам отмечены достоверно лучшие показатели рентгенологического индекса (р<0,05), достоверно меньшая частота обострений бронхолегочного процесса (р<0,05), обусловленная более редкой частотой высева патогенной микрофлоры (р<0,05); значимо меньшая частота декомпенсации кишечного синдрома(р
4. Суммарная частота обнаруженных мутантных аллелей гена СВТЯ (Р508ёе1, СРТЫс1е1е2,3(21кЬ), 2143с1е1Т, 2184твА, 382Ые1Т) и частота
94 гетерозиготных носителей среди новорожденных с гипертрипсиногенемией после первого ИРТ-теста, достоверно выше тех же частот в российской популяции (0,0231 против 0,0068; р<0,05; 0,0358 против 0,0134 р<0,05), что подтверждает влияние гетерозиготного носительства мутаций в гене СРТЯ на внешнесекреторную функцию поджелудочной железы.
5. Условные вероятности МВ, носительства или не носительства мутаций в гене С7
1. Учитывая отсутствие значимых отличий протоколов неонатального скрининга ИРТ/ИРТ и ИРТ/ДНК, отсутствие необходимости получения информированного согласия от родителей при обследовании новорожденного по схеме ИРТ/ИРТ (что имеет место при ДНК-диагностике), а также экономическую выгоду последнего, данный протокол является наиболее оптимальным для использования в РФ.
2. В случае высоких показателей ИРТ после двух, последовательно проведенных этапов скрининга, новорожденным с гипертрипсиногенемией рекомендовано обязательное двукратное проведение потового теста разными методами (определение проводимости электролитов на аппарате Ыапоёис! и концентрации хлоридов в потовой жидкости классическим биохимическим методом по Гибсону-Куку). При отрицательном результате потовой пробы - динамическое наблюдение в центре МВ с повторной консультацией в возрасте 1 года.
3. Для уменьшения количества семей, отказывающихся от обследования на разных этапах скрининга, зачастую, из-за неквалифицированного информирования родителей ребенка о важности проводимо обследования, рекомендовано разработать информационные бюллетени для медицинского персонала детских городских поликлиник (ДТП ), а также для родителей, с кратким описанием заболевания, этапов неонатального скрининга, с указанием контактных данных специализированных центров, где желающие смогут получить квалифицированную консультацию по интересующим вопросам.
4. Предложенный алгоритм комплексного обследования и ведения больных МВ, выявленных по неонатальному скринингу, рекомендован для использования в центрах МВ РФ (схема 9.).
5. Рекомендован изолированный амбулаторный прием (в условиях боксированного отделения) пациентов с разными видами патогенной флоры, для исключения перекрестного инфицирования и раннего контакта вновь выявленных больных с тяжелой инфекцией.
6. Полученные в ходе исследования условные вероятности МВ, носительства или не носительства мутаций в гене СРТЯ у новорожденных с высоким уровнем ИРТ I и И, рекомендованы для использования при медико-генетическом консультировании российских семей группы риска по заболеванию.
Схема 9. Алгоритм обследования и наблюдения больных МВ, выявленных по неонатальному скринингу.
Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Кусова, Залина Ахсаровна, 2011 год
1. Гембицкая Т.Е. Клинические особенности диагностики и лечения некоторых наследственно обусловленных заболеваний органов дыхания у взрослых // Автореф. дисс. . докт. мед. наук. Л., 1987, стр.40.
2. Желенина Л.А. Муковисцидоз у детей: (Клинико-генетические особенности, инфекционный процесс в легких, лечение) // Автореф. дисс. . докт. мед. наук. С.П.,1998, стр. 43.
3. Животовский Л. А. Популяционная биометрия. // М.: Наука. -1991. -стр.271.
4. Зубков М.Н., Самойленко В.А., Гугуцидзе E.H., Чучалин А.Г. Микробиологические аспекты этиологии и антимикробной терапии бронхолегочной инфекции при муковисцидозе у взрослых // Пульмонология, 2001, №3, стр.38-41.
5. Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Биохимические и молекулярно-генетические основы патогенеза мковисцидоза. // «Интермедика », Санкт-Петербург, 2002г, стр.256.
6. Капранов Н.И., Делягин В.М. Муковисцидоз с точки зрения врача общей практики. //Лечащий врач, 1998, №4, http://old.osp.ru/doctore/1998/04/24print .htm
7. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Петрова Н.В. Муковисцидоз. Достижения и проблемы на современном этапе. // Медицинская генетика, 2004, №9, стр.398-412.
8. Капранов Н.И. Муковисцидоз. Рациональная фармакотерапия заболеваний органов дыхания. Под редакцией Чучалина А.Г.,- М." Литтера", 2004, стр.423-448.
9. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю. Фармакотерапия детских болезней / Под редакцией Царегородцева А.Д.,-М., МИА, 2010.- гл.41. Диагностика и терапия бронхолегочной патологии при муковисцидозе. - 2010, стр. 682-690.
10. Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Нарушенное кишечное всасывание у детей / Под ред. В.А.Таболина. М.: СДГ РГА; "РДКБ-ПРЕСС"; ИНТЭК ЛТД. 1999. Гл.: Муковисцидоз. - 1999, стр. 105-126.
11. Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Поражение органов пищеварения и их коррекция при муковисцидозе // Русский медицинский журнал-1997, Т.5. №14, стр.892-898.
12. Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Сухов М.Н. Патология печени муковисцидозе, методы лечения // Российский гастроэнтерологический журнал-1998, № 4, стр.51-57.г
13. Муковисцидоз. Современные достижения и актуальные проблемы. Методические рекомендации. Издание третье (первое 2001) переработанное и дополненное / под ред. Капранова Н. И., Каширской Н. Ю. М.: 4ТЕ Арт. - 2008, стр.124.
14. Петрова Н. В. Определение относительных частот некоторых мутаций гена CFTR и анализ гаплотипов сцепленных с ними ДНК-маркерных локусов в Популяции России. Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 1996. стр.24
15. Петрова Н. В., Тимковская Е. Е., Зинченко Р. А., Гинтер Е. К. Анализ частоты некоторых мутаций в гене CFTR в разных популяциях России // Медицинская генетика. 2006, №2, стр.28-31.
16. Петрова Н.В. Расчеты относительного риска муковисцидоза у новорожденных, выявленных при неонатальном скрининге в разных российских регионах. //Медицинская генетика. - 2008, №12, стр. 8-15.
17. Петрова, Н.В., Гинтер E.K. Определение частоты мутации AF508 среди новорожденных города Москвы и оценка частоты муковисцидоза в Европейской части России // Генетика. 1997. - Т. 33, № 9. - стр.326-328.
18. Петрова Н. В. Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза в российских популяциях // Автореф. дисс. . докт. биол. наук.- М, 2009.
19. Радионович А.М., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Клиническое значение субингибирующих доз клэритромицина при лечении хронического бронхолегочного процесса у детей, больных муковисцидозом.// Детская больница, 2006, №1(23), стр.21-29.
20. Сапелкина JI.B. Сахарный диабет и муковисцидоз // Педиатрия-1965, №2, стр.89-91.
22. Тимковская Е.Е. Анализ ряда генов как возможных генов-модификаторов клинической картины муковисцидоза у больных из России // Автореф. дисс. . канд. мед. наук. М., 2007.
23. Толстова В. Д., Каширская Н. Ю., Капранов Н. И. Массовый скринингноворожденных на муковисцидоз в России // Фарматека. - 2008, №1, стр. 1-5.102
24. Abdul-Karim F.U., Dahms В.В., Velasco et al. Islet of Langergans in adolescents and adults with cystic fibrosis // Arch. Pathol. Lab. Med. - 1986. -V.110. -P.602-610.
25. Andersen. D.H. Cystic Fibrosis of the pancreas and its relation to celiac disease // Am. J. Dis. Child. 1938. - V.56. - P.344-399.
26. Andersen D.H., Hodges R.G. Celiac syndrome; genetics of cystic fibrosis of the pancreas, with a consideration of etiology. // Am J Dis Child. 1946 Jul; V.72. -P.62-80.
27. Armstrong D.S., Grimwood K., Cardin J.B. Lower airway inflammation in infants and young children with cystic fibrosis // Am J Respir Crit Care Med.,1997. V. 156. - P. 1197-1204.
28. Beju D., Knox D., Yates D., et al. The ultrastructure of langergans islets in cystic fibrosis // Pediatric Pulmonology. 1992. - V.9. - Suppl.8. - P.313.
29. Bhaskar K.R., Turner B.S., Grubnian S.A. et al. Dysregulation of proteoglycan production by intrahepatic biliary epithelial cells bearing defective (Delta F508) cystic fibrosis transmembrane conductance regulator // Hepatology. -1998.-V.27.-P.7-14.
30. Bobadilla JL, Farrell MH, Farrell PM. Applying CFTR molecular genetics to facilitate the diagnosis of cystic fibrosis through screening. Adv Pediatr. 2002. -V.49.-P.131-190
31. Borgo G, Mastella G, Gasparini P, Zorzanello A, Doro R, Pignatti, PF. Pancreatic function and gene deletion F508 in cystic fibrosis. J Med Genet., 1990. -V. 27(11). - P.665-9.
32. Brice P., Jarrett J., Mugford M. Genetic screening for cystic fibrosis: An overview of the science and the economics // J. Cystic Fibrosis. - 2007. -V.6. - P.255-261.
33. Brown RK, Wyatt H, Price JF, Kelly FJ. Pulmonary dysfunction in cystic fibrosis is associated with oxidative stress. // Eur. Respir. J., 1996. V. 9. - P.334-339.
34. Castellani C., Southern K. W., Brownlee K. et al. European best practice guidelines for cystic fibrosis neonatal screening // J. Cystic Fibrosis. 2009. -V.8. - P.153-173.
35. Cohn J.A., Strong T.V., Picciotto M.R. et al. Localization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in human bile duct epithelial cells // Gastroenterology. 1993. - V.103. - P.681-693.
36. Colombo C., Apostolo M.G., Ferrari M. et al. Analysis of risk factors for the development of liver disease associated with cystic fibrosis // J. Pediatr. - 1994. -V.124. -P.393-399.
37. Consensus conferences. Nutritional assessment and management in Cystic Fibrosis. Cystic Fibrosis Foundation. - V.l. - Section V. - April 1990. - P. 1-14.
38. Crossley J. R., Elliott R. B., Smith P. A. Dried-blood spot screening for cystic fibrosis in the newborn // Lancet. - 1979;1 (8114): 472-474.
39. Cucinotta D., Conti-Nibali S, Arrigo T., et al. Beta cell function, peripheral sensitivity to insulin and cell autoimmunity in cystic fibrosis patients with normal glucose tolerance. //Horm. Res. 1990. -V.34. -P.33-38.
40. Cystic fibrosis foundation patient registry 1997 annual data report. Bethesda, MD, USA. Cystic Fibrosis Foundation 1998.
41. Cystic Fibrosis Foundation. Patient Registry, 2001 Annual Data. Bethesda, MD: Cystic Fibrosis Foundation; 2002
42. Cystic fibrosis genotype-phenotype consortium. Correlation between» genotype and phenotype in patients with cystic fibrosis // N. Engl. J. Med., 1993. -V.329. - P.1308.
43. Cystic Fibrosis. Liver and biliary disease in cystic fibrosis. Edited by M.E.Hodson, Duncan M.G. Arnold, a member of the Hodder Headline Group, London, UK. - 2000. - P.289-300.
44. Cystic Fibrosis. Second edition. Ed. Hodson M.E., Geddes D.M. Arnold, a member of the Hodder Headline Group, London, UK. - 2000. - P.477.
45. Dankert-Roelse JE, te Meerman GJ. Long term prognosis of patients with cystic fibrosis in relation to early detection by neonatal screening in a cystic fibrosis centre. Thorax 1995. -V. 50. -P.712-718.
46. Darling K.E., Dewar A., Evans T.J. Role of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in internalization of Pseudomonas aeruginosa by polarized respiratory epithelial cells. // Cell Microbiol., 2004. -V. 6(6). -P.521-533.
47. Davidson A.G.F. Gastrointestinal and pancreatic disease in cystic fibrosis. // In "Cystic Fibrosis". Edited by M.E.Hodson and D.M.Geddes, 1995. Chapman &Hall, UK. - P.261-283.
48. De Gracia J., Mata F., Alvarez A., Casals T., Gatner S., Vendrell M., de la Rosa D., Guarner L., Hermosilla E. Genotype-phenotype correlation for pulmonary function in cystic fibrosis // Thorax, 2005. -V.60. P.558-563.
49. Dean T., Dai Y., Shute K., Church MK, Warner JO. Interleukin-8 concentrations are elevated in bronchoalveolar lavage, sputum, and sera of childrenwith cystic fibrosis. // Pediatric Research, 1993. -V.34. -P. 159-161.
50. Demko CA, Stern RC, Doershuk CF. Stenotrophomonas maltophilia in cystic fibrosis: incidence and prevalence: // Pediatr Pulmonol. 1998-May, V.25(5). -P. 304-308.
51. Di Sant1 Agnese P.A., Darling R.C., Perera G.A., Shea E. Abnormal electrolyte composition of sweat in cystic fibrosis of the pancreas; clinical significance and relationship to the disease. // Pediatrics. 1953 Nov; V.12(5). -P.549-563.
52. Donna L Waters, Bridget Wilcken, Les Irwig, Peter Van Asperen, Craig Mellis, Judy M Simpson, John Brown, Kevin J Gaskin. Clinical outcomes of newborn screening for cystic fibrosis. // Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 1999. - V.80. -F1-F7.
53. Döring G, Hoiby N Consensus Study Group.; Early intervention and prevention of lung disease in cystic fibrosis: a European consensus. // J Cyst Fibros. 2004 Jun; V.3(2). -P.67-91. Review.
54. Dörk T, Wulbrand U, Richter T, Neumann T, Wolfes H^ Wulf B, Maass G, Tümmler B. Cystic fibrosis with three mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene.// Hum Genet. 1991 Aug; V.87(4). -P.441-446.
55. Dörk T., M.Macek Jr., F.Mekus. Characterization of a novel 21-kb deletion, CFTRdele2, 3(2 lkb), in the CFTR gene: a cystic fibrosis mutation of Slavic origin common in Central and East Europe. // Hum.Genet., 2000. V.106. -P.259-268.
56. Drumm M.L., Konstan M.W., Schluchter M.D. Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis. // N. Engl.J.Med. 2005. - V.6. -P.353 (14), P.1443-1453.
57. Durie P. Inherited causes of exocrine pancreatic dysfunction // Pediatr. Gastroenterol. 1997. - V.l 1 (2). - P. 145-153.
58. Erika J. Sims, Allan Clark, Jonathan McCormick, et al. Cystic Fibrosis Diagnosed After 2 Months of Age Leads to Worse Outcomes and Requires More Therapy//Pediatrics. -2007. V. 119.-P. 19-28.
59. Ferec C, Verlingue C, Guillermit H, et al. Genotype analysis of cystic fibrosis patients. // Hum Mol Genet. 1993. - V.2. -P: 1557-1560.
60. Ferrari M., Cremonesi E. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis patients // Ann. Biol: Clin. (Paris). - 1996: -V.54. - №6. - P.235-241.
61. Fitzgerald Dv Van Asperen P, Henry R, et al. Delayed diagnosis of cystic fibrosis in children with a rare genotype (ÄF508/R117H). // J Pediatr Child Health. 1995.-V. 31-P. 168-171.
62. Fonkalsrud E., Ellis D., Shaw A. et al: A combined hospital experience with; fundoplication and gastric emptying procedure for gastroesophageal reflux in children // J. Am. Coll. Surg. 1995. - V.180. - P.449-455.
63. Forstner G., Durie P. Cystic Fibrosis // Pediatric Gastrointestinal Disease - 1991,-V.2 P.1179-1197.
64. Gefñier M.E., Lippe B.M. et al. Role of autoimmunity in insulinopenia and carbohydrate derangements associated with cystic fibrosis // J. Pediatr. - 1988. -V.l 12. P.419-420.
65. George D.E., Mangos J.A. Nutritional management and pancreatic enzyme therapy in cystic fibrosis patients: state of art in 1987 and projects into the future // J Paediatric Gastroenterology and Nutrition. -1988. -Suppl.7. P.49-57.
66. Giusti R. New York State Cystic Fibrosis Newborn Screening Consortium. Elevated IRT levels in African-American infants: implications for newborn screening in an ethnically diverse population. Pediatr Pulmonol. -2008. - V.43. -P.638-641.
67. Giusti R. New York State Cystic Fibrosis Newborn Screening Consortium. Elevated IRT levels in African-American infants: implications for newborn screening in an ethnically diverse population // Pediatr. Pulmonol. - 2008. V.43. -P. 638-641.
68. Gomez Lira M, Patuzzo C, Castellani C, Bovo P, Cavallini G, Mastella G, Pignatti PF. CFTR and cationic trypsinogen mutations in idiopathic pancreatitis and neonatal hypertiypsinemia. Pancreatology. 2001. V.l (5). - P.538-42.
69. Green M.R., Weaver L.T. Early and late outcome of cystic fibrosis screening. Journal of the Royal Society of Medicine. 1994. - Suppl. No. 21. - V. 87.
70. Guyatt GH, Oxman AD, Ali M, Willan A, Mcllroy W, Patterson C. Laboratory diagnosis of iron-deficiency anemia: an overview. J Gen Intern Med. - 1992.-V. 7(2).-P. 145-153.
71. Haardt M, Benharouga M, Lechardeur D, Kartner N, Lukacs GL: C-terminal truncations destabilize the cystic fibrosis transmembrane conductance regulatorwithout impairing its biogenesis. A novel class of mutation. J Biol Chem. 1999. -V.274. -P.21873-21877
72. Handwerger S., Roth J., et al. Glucose intolerance in cystic fibrosis // New. Engl. J. Med. -1969. -V.281. -P.451-460.
73. Heeley AF, Fagan DG. Trisomy 18, cystic fibrosis, and blood immunoreactive trypsin. Lancet. 1984. - V. 1. - P. 169-170.
74. Hodson M.E., Duncan M.G. Cystic Fibrosis. Arnold, a member of the Hodder Headline Group, London, UK. 2000. - P.477.
75. Imundo L, Barasch J, Prince A, al-Awqati Q. Cystic fibrosis epithelial cells have a receptor for pathogenic bacteria on their apical surface. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V. 92. -P.3019-3023.
76. Iovanna J, Ferec C, Sarles J, Dagorn JC. The Pancreatitis-Associated Protein (PAP) A new candidate for neonatal screening of cystic fibrosis C R Acad Scien. -1994.-V.317.-P.561-564.
77. Iovanna J, Keim V, Nordback I, et al. Serum levels of pancreatitis-associated protein as indicators of the course of acute pancreatitis. Gastroenterology. -1994. -V.106. -P.728-734.
78. Jensen K. Meconium ileus equivalent in a fifteen year old patient with mukoviscidosis // Acta Paediatr. Scand. 1962. - V.51. -P.344-348.
79. Kerem B, Kerem E: The molecular basis for disease variability in Cystic Fibrosis // Eur. J. Hum .Genet. 1996. - V.4. - P.65-73.
80. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. -1989. -V. 245. -P.l073-1080.
81. Kerem E, Corey M, Kerem B-S, et aL The relation between genotype and" phenotype in cystic fibrosis -analysis of the most common mutation (5F508). NEngl J Med. 1990. -V.323. -P. 1517-1522.
82. Kerem E., Kalman Y.M., Yahav Y. et al. Highly variable incidence of cystic fibrosis and different mutations among different Jewish ethnic groups in Israel // Hum. Genet. 1995.- V.96.-P.193-197.
83. Kharrazi M., Kharrazi L. D. Delayed diagnosis of cystic fibrosis and the family perspective // J. Pediatr. 2005. - V.147. -P. 21-25.
84. Kilinc MO, et al. Highest heterogeneity for cystic fibrosis: 36 mutations account for 75% of all CF chromosomes in Turkish patients. J Med Genet. 2002-V.l 13. -P.250-257.
85. Konstant M., Hillard K., NorvellT. Bronchoalveolar lavage findings in cystic fibrosis patients with stable, clinically mild lung disease suggest ongoing infection and.inflammation // Am. J. Res. Crit. Care. Med. -1994. V.150. - P.448-454.
86. Lakeman P, Gille JJP, Dankert-Roelse JE, et al. CFTR mutations in Turkish and North African cystic fibrosis patients in Europe: implications for screening. Genetic Testing. 2008. -V. 12. -P.25-35.
87. Lippold B.C. What is the ideal size for enteric-coated pancreatin preparations? // Drugs made in Germany. 1998. - V.41. - №2. - P.52-56.
88. Littlewood J.M., Wolfe S.P. Growth, development and nutrition // in the book Cystic Fibrosis, Second edition. Edited by M.E.Hodson, D.M.Geddes. Arnold, a member of the Hodder Headline Group. London, UK. 2000. - P.243-259.
89. Lohr M., Goertchen P., Nizze H. et al. Cystic fibrosis associated islet changes may provide a basis for diabetes. An immunocytochemical and morphological study // Virchows Arch. -1989. -V.414 (2). P.179-185.
90. Loser C., Molgaard A., Folsch U.R. Faecal elastase 1: a novel, highly sensitive, and specific tubeless pancreatic function test // Gut. - 1996. - V.39. -№4. -P.580-586
91. Loubieres Y, Grenet D, Simon-Bouy B, Medioni J, Landais P, Ferec C, Stern M. Association between genetically determined pancreatic status and lung disease in adult cystic fibrosis patients. // Chest. 2002 Jan. - V. 121(1). - P.73-80.
92. Lowe C.U. May C.D., Reed S.C. Fibrosis of the pancreas in infants and children // Am. J. Dis. Child. 1949. - V.78. - 349-374.
93. McKone E.F., Emerson S.S., Edwards K.L., Aitken M.L. Effect of genotype on phenotype and mortality in cystic fibrosis: a retrospective cohort study. // Lancet, 2003. -V.361 (9370). -P.1671-1676.
94. McKone EF, Goss CH, Aitken ML. CFTR genotype as a predictor of prognosis in cystic fibrosis. // Chest. 2006 Nov. -V.130 (5). -P.1441-1447.
95. Mishra A., Greaves R., Massie J. The relevance of sweat testing for the diagnosis of cystic fibrosis in the genomic era. // Clin. Biochem.Rev. 2005. V.26. -P.135-153.
96. Morison S., Dodge J.A., Cole TJ. et al. Height and weight in cystic fibrosis: a cross sectional study // Arch. Dis. Child. 1997. - V.77. - P.497-500.
97. Moya EF, Brocklebank JTB, Littlewood JM, O"Connor LMO, Penney MD. High serum immunoreactive trypsin not caused by cystic fibrosis. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. -1998. -V.78. F.78.
98. Munck A, Dhondt JL, Sahler C, Roussey M. Implementation of the French nationwide cystic fibrosis newborn screening program. J Pediatr. 2008. -V.153. -P.228-233.
99. National Diabetes Data Group. Classification and diagnosis of Diabetes Mellitus and other categories of glucose intolerance // Diabetes. -1979. - V.28. -P.1039-1057.
100. Nguyen T., Louie S.G., Beringer PM, Gill M.A. Potential role of macrolide antibiotics in the management of CF lung desease // Curr. Opin. Pulm. Med. -2002. Vol.8, №6. -P.521-528.
101. Ogino S., Flodman P.,Wilson R.B., Gold B, Grody WW ., Risk calculations for cystic fibrosis in neonatal screening by immunoreactive trypsinogen and CFTR mutation tests. Genet Med. -2005 May-Jun. -V.7 (5). -P.317-327.
102. Park R.W., Grand R.J. Gastrointestinal manifestations in cystic fibrosis: a review // Gastroenterology. -1981. V.81. - P. 1143-1161.
103. Petrova N.V., Timkovskaya E.E., Ginter E.K. Analysis of common mutations and intragenic marker haplotypes in CF and normal samples from Russia. // 7th International Symposium for Cystic Fibrosis, Slovakia. -2003. V.23. -P. 12.
104. Price JF. Newborn screening for cystic fibrosis: do we need a second IRT? Arch Dis Child. 2006. -V. 91. - P.209-210.
105. Priest FJ, Nevin NC. False positive results with immunoreactive trypsinogen screening for cystic fibrosis owing to trisomy 13. J Med Genet. -1991. -V.28. -P.575-576.
106. Quinton PM. Physiological basis of cystic fibrosis: a historical perspective. // Physiol Rev. 1999 Jan. -V.79 (1 Suppl). - S3-S22.
107. Ranieri E, Ryall RG, Morris CP, et al. Neonatal screening strategy for cystic fibrosis using immunoreactive trypsinogen and direct gene analysis. BMJ. -1991. - 302. - P.1237-1240.
108. Riordan JR, Rommens JM, Kerem B, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 1989. - V.245. -P.1066-1073.
109. Roberta Rodrigues, Carmen S. Gabetta, Karla P. Pedro et al. Cystic fibrosis and neonatal screening // Cad. Saude Publica, Rio de Janeiro. 2008. 24 Sup. 4. -S475-S484.
110. Rock M. J., Mischler E. H., Farrell P. M. et al. Newborn screening for cystic fibrosis is complicated by age-related decline in immunoreactive trypsinogen levels //Pediatrics. 1990. -V. 85 (6). -P.1001-1007.
111. Rolles C.J. Hepatology // in Practical Guidelines for Cystic Fibrosis (ed. Hill C.M.). Churchill Livingston: London. -1998. -P.87-90.
112. Rommens JM, Iannuzzi MC, Kerem B, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. -1989. -V.245. -P. 1059-1065.
113. Rosenstein B.J., Eigen H. Risks of alternate-day prednisone in patients with cystic fibrosis // Pediatrics. 1991. -V.87. - P.245-246
114. Rosenstein B.J., Zeitlin P.L.Cystic fibrosis. // Lancet. -1998. -V. 351 -P.277-282.
115. Rowntree RK, Harris A. The phenotypic consequences of CFTR mutations. Review. // Ann. Hum. Genet. 2003 Sep. - V. 67(Pt 5). - P. 471-485.
116. Salvatore F., Scudiero O., Castaldo G. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis: The role of modifier genes. // Am.J.Med.Genet. 2002. -V.lll. -P. 88-95.
117. Sarles J., Barthellemy S., Ferec C. et al. Blood concentrations of pancreatitis associated protein in neonates: relevance to neonatal screening for cystic fibrosis // Arch. Dis. Child Fetal. Neonatal Ed. 1999. -V.80 (2). -P. 118-122.
118. Scheid P, Kempster L, Griesenbach U, Davies JC, Dewar A, Weber PP, Colledge WH, Evans MJ, Geddes DM, Alton EW. Inflammation in cystic fibrosis airways: relationship to.increased bacterial adherence. // Eur. Respir. J. 2001 Jan. -V. 17(1). -P. 27-35.
119. Scheid P, Kempster L, Griesenbach U, Davies JC, Dewar A, Weber PP, ■ Colledge WH, Evans MJ, Geddes DM, Alton EW. Inflammation in cystic fibrosis airways: relationship to increased bacterial adherence. // Eur. Respir. J. -2001 Jan. -V. 17(1).-P. 27-35.
120. Scotet V, de Braekeleer M, Roussey M, et al. Neonatal screening for cystic fibrosis in Brittany, France: assessment of 10 years" experience and impact on prenatal diagnosis. Lancet. 2000. -V.356. -P.789-794.
121. Seltzer WK, Accurso F, Fall MZ, et al., Screening for cystic fibrosis: feasibility of molecular genetic analysis of dried blood specimens. Biochem Med Metab Biol. -1991. -V.46.-P. 105-109.
122. Shwachman H., Hubner H., Catzel P. Mukoviscidosis // Adv. Pediatr. 1955-.- V.7. - P.249-323.
123. Soldan W., Henker J., Sprossig C. Sensitivity and specificity of quantative determination of pancreatic elastase 1 in feces of children // J. Pediatr. Gastr. Nutr.- 1997. V.24. - P.53-55.
124. Southern K. W., Munck A., Pollit R. et al. A survey of newborn screening for cystic fibrosis in Europe // J. Cystic Fibrosis. 2007. -V. 6. -P. 57-65.
125. Strandvik B. Hepatobiliary disease in Cystic fibrosis // Diseases of the liver and biliary system children (ed D.A.Kelly): Blackwell Science Ltd., London, UK. -1999. - P.141-156.
126. Tsui L.C. The spectrum of cystic fibrosis mutation // Trends Genet. 1992. -V.8. - P.392-398.
127. Tsui L-C, Durie P., Genotype and cystic fibrosis. Hospital Practice. -1997. -V.32.-P. 115-142.
128. Van den Akker-van Marie ME, Dankert HM, Verkerk PH, Dankert-Roelse JE. Cost-effectiveness of 4 neonatal screening strategies for cystic fibrosis. // Pediatrics. 2006 Sep. -V.l 18 (3). -P.896-905.
129. Welsh M.J., Smith A.E. Molecular mechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis // Cell. -1993. V.73. -P. 1252-1254.
130. Wesley AW, Smith PA, Elliot RB. Experience with neonatal screening for cystic fibrosis in New Zealand using measurement of immunoreactive trypsinogen.Aust Paediatr J. 1989. -V.25. -P151-155.
131. Wheeler W.B., Colten H.R. Cystic Fibrosis: Current approach to diagnosis and management // Paediatrics in review. -1988. V.9. -N.8. (Feb). - P.241-248.
132. Wilcken B. Newborn screening for cystic fibrosis: its evolution and a review of the current situation. Screening. - 1993. -V.2. -P.43-62.
133. Wilschanski M, Rivlin J, Cohen S, Augarten A et al: Clinical and genetic risk factors for CF-related liver disease // Pediatrics. 1999. - V.103. - P.52-57.
134. Wilschanski M, Rivlin J, Cohen S, Augarten A et al: Clinical and genetic risk factors for CF-related liver disease // Pediatrics. 1999. - V.103. - P.52-57.
135. Wilson R., Dowling R.B., Jackson A.D. The biology of bacterial colonization and invasion of respiratory mucosa // Eur. Resp. Jur. 1996. -V.9. - P.1523-1530.
136. Witt H. Chronic pancreatitis and cystic fibrosis. // Gut. -2003. -V.52. Suppl 2. - P.1131-1141.
137. Yang Y, Raper SE, Cohn JA, Engelhardt JF, Wilson JM. An approach for treating the hepatobiliary disease of cystic fibrosis by somatic gene transfer.// Proc Natl Acad Sci USA. -1993 May. №15. - V.90 (10). -P.4601-4605.
138. Zielenski J, Rozmahel R, Bozon D, Kerem B, Grzelczak Z, Riordan JR, Rommens J, Tsui LC: Genomic DNA sequence of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene. Genomics. -1991. -V. 10. -P.214-228.
139. Zielenski J. Genotype and Phenotype in Cystic Fibrosis. // Respiration. - 2000.-V. 67.-P.l 17-133.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания.
В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.
Основная цель генетического скрининга - выявление в популяции людей с определенным генотипом, который либо обусловливает заболевание, либо предрасполагает к его возникновению, либо может вызвать заболевание у потомства. Основные принципы генетического скрининга были разработаны в 60-х гг. прошлого века, когда его стали применять для выявления фенилкетонурии среди новорожденных. В 1968 г. группа экспертов ВОЗ по итогам скрининга на фенилкетонурию, проводимого в нескольких странах мира, опубликовала общие требования к программам скрининга новорожденных на наследственные болезни обмена веществ. Эти требования действительны и в настоящее время.
Основные принципы генетического скрининга
К общим требованиям выполнения программ скрининга новорожденных на наследственные болезни обмена относят следующие критерии:
частота заболевания в популяции должна быть достаточно высокой (это требование не очень строгое, поскольку связано только с экономической эффективностью программы);
заболевание должно быть хорошо изучено клинически и лабораторно;
заболевание должно быть тяжелым или даже летальным, так, чтобы польза от применения программы скрининга была больше, чем стоимость ее исполнения;
лабораторные тесты не должны давать ложноотрицательных результатов, чтобы не пропустить ни одного больного; частота ложноположительных результатов также не должна быть высокой, чтобы не снижать экономическую эффективность программы;
лабораторные тесты должны быть простыми, безопасными и этически приемлемыми;
должно быть разработано эффективное лечение скринируемых заболеваний;
должен быть точно установлен промежуток времени от рождения, когда лечение дает положительный результат;
скрининг должен быть экономически эффективным.
Исходя из этих требований неонатальный скрининг - это система мероприятий, основными из которых являются выявление новорожденных с определенными заболеваниями на доклинической стадии; раннее патогенетическое лечение, позволяющее дать обществу полноценных индивидуумов; медико-генетическое консультирование семьи, имеющее целью не допустить рождения второго больного ребенка.
Скрининг на наиболее частые и тяжелые наследственные болезни попадает в категорию высокоприоритетных среди прочих проблем здравоохранения, так как он затрагивает мотивацию населения, снижает заметную долю инвалидности и обеспечивает экономию ресурсов. Неонатальный скрининг - принципиально новый подход к профилактике, предложенный медицинской генетикой практическому здравоохранению.
Перечисленным выше требованиям отвечает целый ряд наследственных болезней обмена. В России проводят скрининг новорожденных на фенилкетонурию с 1985 г., на врожденный гипотиреоз - с 1993 г.; в рамках Национального проекта «Здоровье нации» с 2006 г. скрининг дополнен еще тремя заболеваниями - галактоземией, адреногенитальным синдромом и муковисцидозом.
Фенилкетонурия - наследственное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования (больные накапливаются в семье в одном поколении).
Средняя частота фенилкетонурии в странах Европы составляет 1:10 000 новорожденных, в Европейской части России - 1:6500-1:7000. Основной диагностический критерий всех форм фенилкетонурии - повышенная концентрация фенилаланина в крови. Гетерогенная группа гиперфенилаланинемий включает ряд наследственных нарушений метаболизма аминокислоты фенилаланина, результатом которых является накопление этой аминокислоты и ее производных в биологических жидкостях. Наиболее частое нарушение - классическая форма фенилкетонурии, обусловленная мутациями в гене фенилаланингидроксилазы на хромосоме 12 (12q22-q24.2). К настоящему времени в гене фенилаланингидроксилазы идентифицированы многие сотни мутаций, 8 из которых встречаются наиболее часто. Мажорной мутацией, встречаемой с частотой 45%, является R408Q. В результате мутации в гене фермент оказывается дефектным, фенилаланин не может превратиться в тирозин и накапливается в крови.
Возникает метаболический блок, в результате которого уровень фенилаланина постоянно растет и достигает таких концентраций, при которых он становится токсичным, в первую очередь для развивающегося мозга ребенка. Без лечения у 95% детей с фенилкетонурией развиваются тяжелая умственная отсталость, задержка моторного развития, судороги, экзема на коже, а в старшем возрасте присоединяются грубые нарушения в поведении.
Если лечение начать рано и проводить его тщательно, клинические симптомы фенилкетонурии у ребенка не проявятся и он будет расти здоровым, практически не отличаясь от сверстников. Смысл лечения заключается в уменьшении содержания фенилаланина в пище, которую получает ребенок. Обычно этого достигают за счет специальных смесей и диеты. У ребенка постоянно контролируют содержание фенилаланина в крови и в зависимости от лабораторных показателей корректируют состав тех продуктов, которые не будут повышать уровень фенилаланина, а обеспечат нормальные рост и развитие ребенка. Семья, в которой есть больной с фенилкетонурией, должна получить медико-генетическую консультацию, при последующих беременностях может быть проведена пренатальная ДНК-диагностика.
Врожденный гипотиреоз проявляется серьезными нарушениями роста и развития ребенка с рождения и обусловлен полным или частичным нарушением функции щитовидной железы, вырабатывающей йодсодержащие гормоны. В большинстве случаев врожденный гипотиреоз возникает в связи с отсутствием щитовидной железы, либо ее недоразвитием, либо неправильным положением. Если врожденный гипотиреоз не лечить, у ребенка резко замедляется рост, развивается тяжелая необратимая умственная отсталость и появляются другие клинические признаки заболевания. Болезнь все время прогрессирует и может привести к пожизненной инвалидности. Однако если лечение начато в первый месяц после
рождения, в абсолютном большинстве случаев ребенок развивается нормально. Примерно 80-85% случаев врожденного гипотиреоза ненаследственные, они возникают случайно и обычно обусловлены нарушением развития щитовидной железы, причины которого неизвестны. В патогенезе развития транзиторных нарушений функций гипофизарно-тиреоидной системы преимущественное значение могут иметь как повышение активности гипофиза с увеличением синтеза тиреотропного гормона, так и угнетение продукции тиреоидных гормонов.
В группу риска по возникновению транзиторных изменений, сопровождаемых снижением концентрации тиреоидных гормонов, относят:
новорожденных, родившихся от матерей с осложненным течением беременности, особенно с фетоплацентарной недостаточностью;
новорожденных, родившихся от матерей с эндокринной патологией, особенно с заболеваниями щитовидной железы;
новорожденных с функциональной незрелостью вследствие недоношенности или внутриутробной гипотрофии.
В 15-20% случаях врожденный гипотиреоз наследуется, как правило, по аутосомно-рецессивному типу. Известно по меньшей мере 7 генов, мутации которых ведут к гипотиреозу. Именно поэтому молекулярно-генетический анализ при врожденном гипотиреозе сложен и не всегда эффективен. Однако, поскольку врожденный гипотиреоз как наследственной, так и ненаследственной природы при раннем выявлении хорошо лечится, в таком генетическом анализе нет особой нужды.
Врожденный гипотиреоз встречается повсеместно в мире с примерно одинаковой частотой - 1:3000-1:4000 новорожденных. Такая же частота врожденного гипотиреоза и в России. У девочек по невыясненным причинам его обнаруживают вдвое чаще, чем у мальчиков. В программе скрининга используется в качестве первичного теста исследование тиреотропного гормона в образцах пятен высушенной крови. В случаях с повышенным содержанием тиреотропного гормона в образцах крови проводят ретестирование, по результатам которого выявляют больных детей. Врач-генетик направляет больного к эндокринологу, который назначает лечение и наблюдает за ребенком в дальнейшем.
Галактоземия - одно из наследственных нарушений обмена углеводов. В основе патогенеза заболевания лежит дефект одного из ферментов метаболизма - галактозы, которая образуется в кишечнике при гидролизе дисахарида лактозы. Первая стадия превращений галактозы в клетках организма - ее фосфорилирование, которое осуществляется с помощью фермента галактокиназы. Продукт этой реакции - галактозо-1-фосфат метаболизируется с помощью галактозо-1- фосфатуридилтрансферазы в уридилдифосфогалактозу. Дальнейшее преоб-разование последней происходит с помощью уридилдифосфогалактозо-4-эпимеразы. Результат недостаточности любого из трех ферментов - галактокиназы, фосфатуридилтрансферазы или уридилдифосфогалактозо-4-эпимеразы - повышение концентрации галактозы в крови - галактоземия. Как правило, под галактоземией подразумевают дефекты фосфатуридилтрансферазы, наиболее тяжелым из которых является классическая форма галактоземии. Частота классической формы, по лите-ратурным данным, составляет 1:50 000-1:60 000 новорожденных.
Выделяют две формы галактоземии. Классическая галактоземия, обусловленная недостаточностью галактокиназы, наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Ген локализован в локусе 9р13. Начало заболевания острое, в неонатальном периоде появляются рвота, диарея, желтуха, гепатомегалия, катаракта, гипотрофия, задержка психомоторного развития, почечнотубулярная дисфункция.
Галактоземия, обусловленная системной недостаточностью уридилдифосфогалактозо-4-эпимеразы, наследуется также по аутосомно-рецессивному типу. Ген локализован в локусе 1р36-р35. Начало заболевания - в неонатальном периоде. Симптомы заболевания те же, кроме катаракты (отсутствует), но имеется нейросенсорная глухота. Для этих двух форм описан бессимптомный доброкачественный вариант галактоземии (вариант Дуарте), популяционная частота которого выше частоты классической формы.
Если лечение начато рано, клинические симптомы галактоземии у ребенка не проявятся, он будет расти здоровым. Смысл лечения заключается в исключении пищевых продуктов, содержащих галактозу, прежде всего грудного молока и других молочных смесей. Они могут быть заменены специальными смесями, приготовленными на основе сои. Раннее назначение лечения, оптимально - до 10-го дня жизни, позволяет избежать тяжелых кризов, которые нередко приводят к летальному исходу. В медико-генетической консультации возможна пренатальная ДНК-диагности- ка при последующих беременностях.
Муковисцидоз - одно из наиболее частых наследственных заболеваний, обычно имеющее тяжелое течение и плохой прогноз для жизни. Частота муковисцидоза колеблется среди представителей европейской расы от 1:600 до 1:12 000 новорожденных. Ген муковисцидоза CFTR картирован на длинном плече хромосомы 7. Количество идентифицированных в настоящее время мутаций в этом гене превышает 2000, из которых наиболее частой является delF508, обнаруживаемая у 54% больных с муковисцидозом в России.
Ген отвечает за синтез белка, служащего каналом для ионов хлора в клетках. Вследствие нарушения функции этого канала слизь и другие секреты в легких, поджелудочной железе и других органах становятся очень густыми и вязкими. Это приводит к развитию хронической инфекции, повреждению легочной ткани, нарушению переваривания пищи, поскольку ферменты поджелудочной железы не могут попасть в кишечник. Заболевание обычно начинается в раннем возрасте. Различают три основные формы муковисцидоза: легочную, кишечную и смешанную. Самая частая из них - смешанная форма. Она встречается примерно у 80% больных с муковисцидозом. Легочная форма проявляется хроническим обструктивным бронхолегочным процессом. Развивается хронический воспалительный процесс, приводящий к разрушению легочной ткани. Кровь больных плохо насыщается кислородом, из-за чего страдают сердце, печень и другие органы, дети отстают от своих сверстников в росте и по массе тела. Лечение больных с легочной формой муковисцидоза требует применения мощных антибиотиков в больших дозах. При кишечной форме муковисцидоза нарушен процесс переваривания пищи, так как ферменты поджелудочной железы, расщепляющие белки и жиры, не попадают в кишечник вследствие закупорки протоков железы. Основное лечение кишечной формы заключается в приеме ферментов поджелудочной железы. При смешанной форме муковисцидоза кишечные проявления усугубляют поражение легких. Лечение смешанной формы наиболее сложное. У больных с муковисцидозом, не получающих необходимого лечения, продолжительность жизни короткая. Если муковисцидоз выявляют у новорожденного и его начинают лечить уже со 2-го месяца жизни, клинические проявления заболевания значительно легче и ребенок практически нормально развивается физически и умственно. У него увеличивается продолжительность жизни, которая в настоящее время благодаря адекватному лечению составляет в развитых странах более 35 лет.
В программе скрининга используется в качестве первичного теста исследование содержания иммунореактивного трипсина в образцах пятен высушенной крови. Если первое и второе лабораторные исследования оказались положительными, то, в отличие от других скринируемых наследственных болезней, это еще не означает, что у ребенка есть муковисцидоз, хотя вероятность такого диагноза высока. Для подтверждения диагноза младенцу в возрасте 3-4 нед проводят лотовый тест - измерение концентрации хлора в потовой жидкости. Если лотовый тест отрицателен, ребенка считают здоровым, хотя за ним еще будут наблюдать некоторое время. Если же лотовый тест положителен, диагноз муковисцидоза считается установленным даже до появления каких-либо клинических проявлений заболевания.
Адреногенитальный синдром - группа заболеваний, в основе которых лежит дефект одного из ферментов или транспортных белков, принимающих участие в биосинтезе стероидных гормонов надпочечников. Большинство случаев заболевания (около 90-95%) ассоциировано с дефицитом 21-гидроксилазы, 5-10% - с дефицитом 11-р-гидроксилазы.
Ген 21-гидроксилазы (CYP21B) картирован в локусе 6р21.3 вместе с псевдогеном CYP21A. Высокая степень гомологии и тандемное расположение двух генов может приводить к их рекомбинации и нарушению функций активного гена. Идентифицированы десятки мутаций, приводящих к недостаточности 21-гидроксилазы. Точковые мутации составляют приблизительно 80%, на долю делеций приходится около 20% изменений. Наиболее частые точковые мутации - 12splice, далее I172N и др. Частота дефицита 21-гидроксилазы достаточно высока и составляет 1:8000-1:15 000 новорожденных. Поздняя диагностика, несвоевременное и неправильное лечение могут привести к тяжелым последствиям: гибели ребенка от сольтеряющих кризов, ошибкам в выборе половой принадлежности при выраженной вирилизации наружных гениталий у девочек, нарушениям роста, полового созревания, бесплодию. Внедрение неонатального скрининга позволяет своевременно выявить заболевание и избежать диагностических ошибок.
Выделяют три клинических фенотипа адреногенитального синдрома:
сольтеряющую форму - с рождения «сомнительные» гениталии; в неонатальном периоде - тяжелая потеря соли, проявляющаяся в виде адреналовых кризов (рвоты, дегидратации, судорог, остановки сердца);
простую вирилизирующую форму - с рождения «сомнительные» гениталии у девочек, нормальные у мальчиков, постнатально у обоих полов преждевременное появление вторичных половых признаков, низкорослость;
аттенуированную (неклассическую) форму - начало в пубертатном периоде и только у девочек (слабое развитие молочных желез, оволосение по мужскому типу, аменорея).
Эти три формы составляют примерно 90% всех случаев врожденной гиперплазии коры надпочечников, из них на долю сольтеряющей формы приходится 60-65%. В результате недостаточности 21-гидроксилазы нарушается превращение холесте- рола в кортизол и альдостерон, контролируемое этим ферментом. Одновременно происходит накопление предшественников кортизола и альдостостерона, которые в норме превращаются в мужские половые гормоны - андрогены. Поскольку при адреногенитальном синдроме предшественников кортизола и альдостерона накапливается много, образуется значительно больше, чем в норме, андрогенов, что является основной причиной развития клинической картины адреногенитального синдрома. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу. В программе скрининга используется в качестве первичного теста исследование концентрации 17-гидроксипрогестерона в образцах пятен высушенной крови. В случаях с повышенным его содержанием проводят ретестирование и, таким образом, выявляют больных детей. Лечение должно быть назначено как можно быстрее, тогда клинические симптомы адреногенитального синдрома у ребенка не проявятся и он будет расти здоровым, не отличаясь от сверстников. В медико-генетических консультациях может быть проведена пренатальная ДНК-диагностика при последующих беременностях.
Основные этапы неонатального скрининга
Условно можно выделить 5 этапов проведения скрининга новорожденных на наследственные болезни.
1-й этап - взятие крови у новорожденных из пятки в родовспомогательных учреждениях на 4-5-е сутки жизни. Для всех методов сбора образцов крови на фильтровальную бумагу должны быть разработаны и опубликованы стандарты. В идеальном варианте учреждения необходимо обеспечивать видеоматериалами. Кроме того, система транспортировки высушенных образцов крови должна быть проста и доступна, что позволит провести анализ и начать лечение в короткие сроки, например при галактоземии и адреногенитальном синдроме в течение 10 дней с момента рождения, до появления кризов.
2-й этап - быстрое проведение первичного скрининга по определению соответствующих лабораторных показателей. Такой анализ проводят в лабораториях, имеющих соответствующее оборудование.
3-й этап - подтверждающая диагностика при положительных результатах, ее необходимо проводить в тех же лабораториях в максимально короткие сроки. ДНК-диагностику и контроль качества лабораторных анализов на 2-м и 3-м этапе проводят в федеральных референтных центрах.
4-й этап - лечение выявленных больных, которое должны проводить врачи-генетики, неонатологи, педиатры и эндокринологи. Лечение необходимо назначать в течение первого месяца жизни. Контроль эффективности лечения проводят с использованием клинических и лабораторных данных.
5-й этап - медико-генетическое консультирование и пренатальная ДНК-диагностика в семьях, где появился больной ребенок. Его проводят в медико-генетических консультациях.
Все этапы должны быть полностью подготовлены, тогда можно приступать к выполнению программы. Для успешного ее развития многие проблемы должны быть обозначены и решены на этапе планирования программы. Прежде всего важны правительственная поддержка и финансовые ресурсы, поскольку в нашей стране, как и в большинстве стран мира, неонатальный скрининг - государственная программа.
Непосредственно с выполнением программы связаны:
обучение персонала роддомов (сбор образцов крови);
возможности лабораторий (оборудование) и подготовка персонала;
наличие нормальных значений изучаемых показателей для скринируемой популяции новорожденных;
схема транспортировки образцов крови;
координация работы лабораторий;
создание условий для сбора данных и оповещения врачей;
создание компьютеризированной системы хранения информации об образцах крови, заключениях, оповещениях родителей, выявленных больных, лечении и его результатах;
программа контроля качества работы лабораторий;
доступность медицинской помощи.
Эффективный способ поддержания качественного выполнения всех разделов программы - подготовка практических рекомендаций с детальным описанием процедур каждого этапа программы. Кроме того, необходимо подготовить общее пособие (руководство), в котором будет обобщен практический опыт по решению возникающих проблем. Одно из важных условий успешного выполнения программы неонатального скрининга - подготовка населения, так называемый образовательный блок программы. Люди должны знать, что такое скрининг новорожденных, как его проводят, какая польза от него каждому человеку в популяции.
В проведении скрининга новорожденных, по крайней мере в нашей стране, участвуют три учреждения: родильные дома (забор крови у новорожденных), медико-генетические консультации (проведение 2-го и 3-го этапа, лечение некоторых заболеваний и лабораторный контроль лечения всех скринируемых заболеваний, медико-генетическое консультирование семьи), референсные центры (лабораторный контроль качества, ДНК-диагностика). Существует международная сеть программ скрининга.
Лабораторные исследования
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ
Биологическим материалом, используемым для неонатального скрининга, слу¬жит кровь, высушенная на фильтровальной бумаге.
Получение биологического материала
Взятие крови у каждого новорожденного выполняют строго на 4-5-й день жизни (не ранее 72 ч после рождения) в медицинском учреждении, где в этот момент находится ребенок. К моменту взятия крови ребенок должен не менее суток получать полноценное питание. У недоношенных детей кровь берут на 7-й и 14-й день жизни. У детей, перенесших переливание крови или гемодиализ, взятие крови проводят повторно через месяц после последней процедуры.
Взятие крови проводят только на специальные бланки фильтровальной бумаги, в настоящее время - Whatman 903. Снабжение бланками всех медицинских учреждений проводит медико-генетическая лаборатория региона. Использование для этой цели любой другой бумаги или бланков недопустимо, поскольку лабораторные измерения, их оценку и интерпретацию осуществляют с использованием калибровочных проб и контрольных материалов, сделанных на этом же типе бумаги. Перед взятием образца крови пятку новорожденного необходимо вымыть, протереть стерильной салфеткой, смоченной 70% раствором этанола, и промокнуть сухой стерильной салфеткой. Использование вместо этанола других дезинфицирующих растворов нежелательно, так как некоторые из них могут влиять на результат измерений. Кровь берут с помощью одноразового скарификатора. Первую каплю после прокалывания снимают сухой стерильной ваткой во избежание гемолиза. Каждый из обозначенных на бланке кружков пропитывают насквозь одной большой каплей крови, не касаясь бланком пятки ребенка. Пятна крови должны быть не менее обозначенного на бланке размера, вид пятен одинаков с обеих сторон бланка. Данного количества крови достаточно для скрининговых исследований. В случае неполного заполнения кружков кровью необходимо повторить прокалывание. Бланки с кровью высушивают в течение 2-3 ч при комнатной температуре, избегая попадания прямых солнечных лучей. У старших детей брать кровь следует обычным образом - из пальца.
На бланк с кровью четко и разборчиво записывают следующую информацию: фамилию, имя, отчество матери, если взятие крови осуществляют в родовспомогательном учреждении, или ребенка, если кровь берут в другом медицинском учреждении; дату рождения ребенка, дату взятия крови, подробный адрес прописки и дату выбытия ребенка, номер телефона, код медицинского учреждения и фамилию лица, взявшего кровь. Далее записывают сопутствующую информацию: массу тела ребенка, срок гестации, недоношенность, перенесенное ребенком переливание крови, гемодиализ, прием матерью и/или ребенком лекарственных препаратов, в частности дексаметазона, гипербилирубинемию более 30 мг/дл и др.
Бланк является документом, заполняющий отвечает за правильность взятия крови и достоверность указанных на бланке сведений. Бланки с кровью высушивают при комнатной температуре, упаковывают в чистый бумажный конверт и доставляют в региональную медико-генетическую лабораторию не реже одного раза в 3 дня. Образцы крови, взятые с нарушениями, оценивают как непригодные для анализа. В этом случае необходимо выполнить повторное взятие крови.
Общие принципы процедуры анализа и контроль качества лабораторных исследований
В медико-генетической лаборатории, осуществляющей неонатальный скрининг в данном регионе, оценивают качество полученного биологического материала. Бланки с кровью сортируют и регистрируют в компьютерной базе. Из каждого образца крови выбивают пять дисков диаметром 3 мм, которые далее помещают в пять отдельных микропланшетов. В каждом из микропланшетов проводят измерение одного аналита, являющегося биохимическим маркером заболевания. Для фенилкетонурии маркером служит концентрация фенилаланина в крови, для врожденного гипотиреоза - уровень тиреотропного гормона, для муковисцидоза - иммунореактивный трипсиноген, для галактоземии - общая галактоза, для адреногенитального синдрома - 17-гидроксипрогестерон.
В 96-луночный микропланшет помещают калибровочные пробы, содержащиеся в составе набора реагентов, контрольные материалы с известной концентрацией аналита и исследуемые образцы крови новорожденных. Далее проводят стандартную процедуру анализа в соответствии с инструкцией набора. Результаты измерений каждого планшета представлены в напечатанном виде, содержащем значения флюоресценции калибраторов, калибровочную кривую, значения флюоресценции и концентрацию аналита в контрольных материалах, флюоресценцию и значения концентрации аналита в исследуемых образцах крови.
Оценка измеренных концентраций аналитов в контрольных материалах позволяет осуществлять внутрилабораторный контроль качества. В установочной серии, содержащей не менее 20 измерений, каждая лаборатория определяет собственные средние значения и допустимые отклонения. Результаты измерений всех планшетов вносят в контрольную карту. Если значения контрольных материалов отвечают требованиям, изложенным в приказе М3 РФ № 45 от 07.02.2000 г. «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения РФ», результат измерения планшета оценивают как приемлемый. В противном случае планшет переделывают.
Лаборатории неонатального скрининга участвуют также в Федеральной системе внешней оценки качества, служащей внешним независимым контролем, который необходим для оценки правильности проводимых исследований и выявления системных ошибок. Наряду с этим ряд лабораторий РФ данного профиля являются участниками международного контроля качества, в частности CDC.
НЕОНАТАЛЬНЫЙ СКРИНИНГ НА ФЕНИЛКЕТОНУРИЮ
Скрининг на фенилкетонурию - стандарт программ неонатального скрининга, поскольку более чем за 40 лет его проведения накоплен огромный материал по этиологии заболевания, лабораторным методам диагностики и лечению. В настоящее время существует широкий перечень методов измерения концентрации фиброаденомы, начиная с используемого до настоящего времени ингибиторного микробиологического теста и заканчивая тандемной масс-спектрометрией. В РФ определение уровня фиброаденомы в сухих пятнах крови проводят микропланшетным флюориметрическим методом. Принцип измерения концентрации фиброаденомы в сухом пятне крови основан на образовании флюоресцирующего комплекса фиброаденомы с нингидрином, интенсивность флюоресценции которого усиливается при взаимодействии с дипептидом L-лейцил-b-аланином. Флюоресценцию измеряют с помощью многофункционального анализатора при длине волны 485 нм. Интенсивность флюоресценции прямо пропорциональна количеству фиброаденомы в образце крови. Программное обеспечение сопоставляет интенсивность флюоресценции исследуемых проб крови с флюоресценцией калибровочных проб. Правильность проведения анализа оценивают по значениям фиброаденомы в контрольных пробах.
Интерпретация результатов
Принципиальным является пороговое значение концентрации фиброаденомы, вырабатываемое лабораторией с учетом рекомендованного фирмой-производителем набора реагентов, популяционных значений уровня аналита для новорож¬денных данного региона, а также информации из аналогичных лабораторий РФ и зарубежья. Для выбора этого показателя важна оценка количества ретестов, которое зависит от значения cut-off. Для новорожденных и детей первого месяца жизни наиболее часто в качестве порогового принимают уровень фиброаденомы, равный 2 мг/дл (120 мкмоль/л), для детей старше одного месяца - 3 мг/дл (150 мкмоль/л). Образцы крови, в которых результат первого измерения фиброаденомы оказался аномально высоким, анализируют дополнительно в параллельном анализе, используя тот же образец крови. Все дети, у которых при параллельном измерении уровень фиброаденомы оказался выше значения cut-off, подлежат повторному обследованию.
Получение второго образца крови от ребенка (ретест) осуществляют по месту жительства или в медицинском учреждении, где он находится. Для этого, в зависимости от степени повышения концентрации аминокислоты, используя информацию на бланке с кровью, устанавливают контакт с семьей. Если превышение уровня фиброаденомы незначительное - до 3 мг/дл (181,5 мкмоль/л), семью уведомляют письмом о необходимости повторного исследования. При значительном увеличении фиброаденомы - более 3 мг/дл - возникает необходимость экстренного контакта с семьей. Местный контроль обеспечения ретестов осуществляет главный педиатр управления здравоохранения района, города, с которым лаборатория осуществляет постоянный контакт по телефону или с помощью электронной почты.
В большинстве случаев, особенно у детей с небольшим первичным повышением, уровень фиброаденомы при анализе ретеста нормален. Первоначальное повышение показателя могло быть связано с незрелостью ферментных систем печени, особенностями течения родов, недоношенностью, с тяжелым общим состоянием ребенка и т. д.
Детям с повторным повышением концентрации фиброаденомы в ретесте от 3 до 8 мг/дл (150-484 мкмоль/л) ставят диагноз «гиперфенилаланинемия». Они нуждаются в регулярном лабораторном контроле уровня фиброаденомы и в наблюдении врачом- генетиком, который решает вопрос о целесообразности или нецелесообразности назначения лечения. При обнаружении в ретесте уровня фиброаденомы, равного или более 8 мг/дл (484 мкмоль/л), диагноз «фенилкетонурия» считают подтвержденным, поскольку этот показатель служит достоверным лабораторным критерием заболевания. Родителей с ребенком приглашают в медико-генетическую консультацию. Врач-генетик срочно назначает ребенку соответствующее лечение с ограничением фиброаденомы и обучает родителей расчету диеты. По современным стандартам диагноз фенилкетонурии должен быть поставлен и лечение начато не позже месяца жизни ребенка. Последующее лечение, проводимое многие годы, осуществляют под постоянным биохимическим контролем уровня фиброаденомы в крови, также выполняемым медико-генетической лабораторией. Оптимальной концентрацией аминокислоты в крови в процессе лечения считают интервал от 1 до 6 мг/дл (60,5-363 мкмоль/л).
НЕОНАТАЛЬНЫЙ СКРИНИНГ НА ВРОЖДЕННЫЙ ГИПОТИРЕОЗ
Этиология врожденного гипотиреоза различна, однако для всех его форм характерна недостаточность тиреоидных гормонов. В связи с малой специфичностью и стертостью клинических симптомов у новорожденных ранняя диагностика врожденного гипотиреоза возможна только на основании исследования уровня тиреоидных гормонов. В основе скрининга лежит определение уровня тиреотропного гормона, который повышается при первичных формах заболевания. Измерение уровня тиреотропного гормона в сухих пятнах крови проводят методом лантанидного иммунофлюоресцентного анализа с разрешением по времени, используют «сэндвич» высокоспецифичных моноклональных антител против двух различных участков на молекуле тиреотропного гормона. Уровень флюоресценции устойчив, ее интенсивность прямо пропорциональна количеству тиреотропного гормона в образце.
Интерпретация результатов
Интерпретацию полученных при скрининге значений тиреотропного гормона проводят с учетом рекомендованного фирмой-производителем набора реагентов и популяционных данных об уровне тиреотропного гормона для новорожденных региона. Для анализов, взятых на 4-7-й день жизни ребенка, cut-off равен 14 мкМЕ/мл, для детей в возрасте старше 14 дней - 5 мкМЕ/мл. В качестве порогового значения, позволяющего заподозрить гипотиреоз с высокой степенью вероятности, используют величину 80 мкМЕ/мл. Все дети с уровнем тиреотропного гормона выше этого значения подлежат повторному обследованию, т. е. вызову на ретест в экстренном порядке. Повторно полученную кровь таких детей необходимо доставить в лабораторию в течение 48 ч после взятия. Детей с повторно обнаруженным повышением уровня тиреотропного гормона направляют к эндокринологу для верификации диагноза (врожденный или транзиторный гипотиреоз) и назначения лечения.
НЕОНАТАЛЬНЫЙ СКРИНИНГ НА ГАЛАКТОЗЕМИЮ
В настоящее время в качестве схем скрининга на галактоземию применяют различные алгоритмы (вместе или по отдельности): измерение концентрации галактозы и галактозо-1-фосфата, анализ ферментативной активности галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы.
Использование концентрации галактозы в крови в качестве диагностического критерия позволяет одновременно с дефектом галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы выявлять дефициты галактокиназы и уридилдифосфогалактозо-4-эпимеразы, поскольку концентрации этих аналитов повышены во всех трех случаях. Однако при введенном ограничении в диете этот показатель неинформативен.
Преимущество анализа ферментативной активности галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы - ее независимость от характера питания и пищевых ограничений, если таковые введены до обследования. Однако в случае предшествующего переливания крови может быть получен ложноотрицательный результат. С другой стороны, условия получения, транспортировки и хранения материала (температура, влажность) могут привести к снижению активности термолабильного фермента, т. е. к ложноположительному результату.
В некоторых зарубежных программах неонатального скрининга применяют молекулярно-генетические методы для поиска наиболее частых мутаций в гене галактозо-1-фосфатуридилтрансфераза. Этот поиск выполняют параллельно исследованию биохимических показателей или в качестве последующего этапа в исследовании крови из того же бланка. Применение ДНК-анализа позволяет оптимизировать скрининг - уменьшить количество ложноположительных результатов, дифференцировать классическую форму и т. д. Однако возможность идентификации ограниченного количества мутаций не дает возможности охватить все варианты заболевания. Уровень галактозы повышен при всех формах галактоземии. Именно поэтому этот критерий используют в качестве первичного биохимического показателя.
Измерение общей галактозы в сухих пятнах крови проводят микропланшетным флюориметрическим методом. Используемый галактозоксидазный метод позволяет количественно определять концентрацию общей галактозы, т. е. сумму концентраций свободной галактозы и галактозо-1-фосфата. Правильность измерения аналита оценивают, осуществляя внутрилабораторный контроль качества по определению его концентрации в контрольных материалах.
Интерпретация результатов
Интерпретацию полученных при скрининге значений общей галактозы проводят с учетом cut-off, который вырабатывают, ориентируясь на рекомендуемый фирмой-производителем набор реагентов, популяционные данные региона и имеющийся опыт. В качестве пороговой концентрации общей галактозы для новорожденных в большинстве лабораторий РФ принято значение 7 мг/дл (385 мкмоль/л), рекомендованное производителем тест-системы. Детям, в образцах крови которых концентрация аналита выше 7 мг/дл, необходим повторный анализ.
Экстренность получения второго образца крови от ребенка (ретеста) зависит от степени повышения общей галактозы. Поскольку для классической формы галактоземии характерна острая, тяжелая манифестация в период новорожденности, угрожающая жизни, при значении общей галактозы, превышающем 15 мг/дл (825 мкмоль/л), необходимо срочно связываться с семьей и главным педиатром территории для получения сведений о состоянии ребенка и получении ретеста. В случае подтверждения в ретесте повышенного уровня этого показателя и исходя из состояния здоровья ребенка неонатолог или педиатр может принять решение о срочном переводе ребенка на безгалактозную диету, не дожидаясь результатов лабораторной верификации диагноза.
Повышенная концентрация галактозы в крови - необходимый, но недостаточный критерий для диагностики галактоземии. Небольшое повышение концентрации аналита характерно для формы Дуарте. Кроме того, особенности течения родов, тяжелое общее состояние ребенка, недостаточность функций печени, хромосомные заболевания приводят к подъему уровня галактозы в крови.
Уточнение формы галактоземии требует обязательного дополнительного обследования - исследования ферментативной активности галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы и анализа мутаций в гене галактозо-1-фосфатуридилтрансфераза или его секвенирования. Поскольку ДНК-анализ позволяет исследовать ограниченное количество мутаций, обнаружение недостаточности ферментативной активности галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы является важным диагностическим критерием. Если диагноз подтвержден, ребенку срочно назначают безгалактозную диету и проводят медико-генетическое консультирование семьи. Дальнейшее лечение ребенка осуществляют под контролем определения галактозы в крови.
НЕОТАТАЛЬНЫЙ СКРИНИНГ НА МУКОВИСЦИДОЗ
Существует ряд схем неонатального скрининга на муковисцидоз, первый этап которых - определение уровня иммунореактивного трипсиногена. Трипсиноген - один из основных продуктов секреции поджелудочной железы, единственный из ферментов, который продуцируется только поджелудочной железой, поэтому он является специфическим маркером панкреатической функции. При муковисцидозе наблюдают повышение уровня иммунореактивного трипсиногена в крови в первые 2 мес жизни ребенка. Далее уровень иммунореактивного трипсиногена снижается и достигает среднепопуляционных значений.
Результаты, полученные при измерении уровня иммунореактивного трипсиногена, далее дополняют потовой пробой и/или ДНК-анализом в различных сочетаниях:
ИРТ -> потовая проба -> ДНК-анализ;
ИРТ -> ДНК-анализ -> потовая проба;
ИРТ 1 -> ИРТ 2 -> потовая проба -> ДНК-анализ.
В России общепринята последняя схема. Измерение уровня иммунореактивного трипсиногена в сухих пятнах крови проводят методом лантанидного иммунофлюоресцентного анализа с разрешением по времени, используют «сэндвич» высокоспецифичных моноклональных антител против двух различных участков на молекуле иммунореактивного трипсиногена. Флюоресценция устойчива, ее интенсивность прямо пропорциональна количеству иммунореактивного трипсиногена в образце.
Интерпретация результатов
Интерпретацию полученных при скрининге значений иммунореактивного трипсиногена проводят с учетом cut-off, набора реагентов, рекомендованного фирмой-производителем и Российским центром муковисцидоза. Для детей в возрасте до 21 дня нормальными считают значения иммунореактивного трипсиногена до 70 нг/мл. Для детей более старшего возраста cut-off равен 40 нг/мл.
Иммунореактивный трипсиноген не является специфичным маркером заболевания, по его первичному значению невозможно поставить диагноз. Именно поэтому все дети с повышенным уровнем иммунореактивного трипсиногена нуждаются в повторном обследовании. Для повторного обследования на муковисцидоз (получения ретеста) существует строго ограниченный срок: от 21 дня до 2 мес жизни. Кровь, взятая в более позднем возрасте, к исследованию непригодна из-за неинформативности теста. Диагноз должен быть снят или подтвержден другими методами. Повышение уровня иммунореактивного трипсиногена может быть обусловлено особенностями течения родов - длительным безводным периодом, стремительными родами, а также особенностями течения послеродового периода - неонатальным стрессом, респираторным дистресс-синдромом, гипогликемией, врожденными инфекциями, атрезией кишечника, тяжелыми врожденными и хромосомными заболеваниями и др.
Потовая проба и ДНК-анализ
Дети с выявленным повышением иммунореактивного трипсиногена в ретесте, а также не прошедшие повторного обследования на иммунореактивный трипсиноген по возрасту нуждаются в проведении второго этапа скрининга - потовой пробе. Потовая проба - измерение концентрации хлора в потовой жидкости - основной патогномоничный диагностический критерий муковисцидоза. Классическим, но длительным по времени и трудоемким способом проведения потового теста остается определение концентрации хлора в поте путем его титрования по методу Гибсона и Кука. В настоящее время исследование проводят с помощью аппарата, измеряющего электрическую проводимость пота, эквивалентную концентрации хлора. Сбор пота осуществляют на предплечье ребенка с предварительным проведением на месте сбора пилокарпинового электрофореза. Нормальный интервал концентраций хлора, рекомендованный фирмой-производителем реагентов, - 0-60 ммоль/л пота. Значения 61-80 ммоль/л считают сомнительными, требующими перепроверки, повтора и клинического наблюдения в динамике. Концентрацию хлора более 80 ммоль/л ассоциируют с муковисцидозом.
Параллельно измерению иммунореактивный трипсиноген выполняют анализ частых мутаций, в частности delF508 и других следующих по частоте, что служит важным диагностическим критерием для данного заболевания и оптимизирует неонатальный скрининг. Однако, поскольку количество известных мутаций в гене велико, исследование частых мутаций не всегда позволяет подтвердить или опровергнуть диагноз. Именно поэтому диагноз всегда должен быть подтвержден потовой пробой. Детей с подтвержденным диагнозом направляют для лечения и диспансерного наблюдения в региональный центр. Врач-генетик осуществляет медико-генетическое консультирование семьи.
НЕОНАТАЛЬНЫЙ СКРИНИНГ НА АДРЕНОГЕНИТАЛЬНЫЙ СИНДРОМ
Первый этап неонатального скрининга на адреногенитальный синдром - определение уровня 17-гидроксипрогестерона, который является предшественником кортизола. Уровень 17-гидроксипрогестерона повышен при обеих формах адреногенитального синдрома, вызванных дефицитом 21-гидроксилазы или 11-b-гидроксилазы, что позволяет выявлять более 95% детей с адреногенитальным синдромом. При других формах адреногенитального синдрома уровень 17-гидроксипрогестерона не изменяется, однако частота этих форм низка. Определение уровня 17-гидроксипрогестерона в сухих пятнах крови проводят методом лантанидного иммунофлюоресцентного анализа с разрешением по времени. Тест основан на конкуренции меченного европием 17-гидроксипрогестерона и 17-гидроксипрогестерона крови новорожденного за центр связывания со специфичными для 17-гидроксипрогестерона моноклональными антителами. Флюоресценция устойчива, ее интенсивность обратно пропорциональна количеству 17-гидроксипрогестерона в образце.
Интерпретация результатов
Интерпретацию полученных значений 17-гидроксипрогестерона проводят с учетом рекомендованного фирмой-производителем набора реагентов и НИИ детской эндокринологии ГУ ЭНЦ РАМН. Для доношенных детей сроком гестации более 37 нед и массой тела более 2000 г cut-off 17-гидроксипрогестерон в крови составляет 30 нмоль/л. В качестве порогового значения, позволяющего заподозрить адреногенитальный синдром с высокой степенью вероятности, используют величину 90 нмоль/л.
Для недоношенных детей со сроком гестации 33-36 нед и массой тела менее 2000 г пороговый уровень 17-гидроксипрогестерона равен 60 нмоль/л. У детей с глубокой недоношенностью (срок гестации - 23-32 нед) результат считают положительным при уровне 17-гидроксипрогестерона более 150 нмоль/л.
Помимо недоношенности, ложноположительные результаты могут быть получены у детей с тяжелым общим состоянием, на фоне внутривенной трансфузии, при высокой билирубинемии (более 30 мг/дл). У детей, получающих дексаметазон (или в случае приема препарата матерью), может быть получен ложноотрицательный результат. Детей с повторным повышением уровня 17-гидроксипрогестерона в ретесте направляют к детскому эндокринологу для верификации диагноза и назначения лечения. Всем детям с диагнозом адреногенитального синдрома, их родителям и членам семьи необходимо проведение молекулярно-генетического исследования и медико-генетического консультирования.
В заключение следует подчеркнуть, что любая программа скрининга с использованием современных алгоритмов и лабораторных методов не выявляет 100% пациентов с данным заболеванием, что объективно обусловлено различными формами заболеваний, недостаточными чувствительностью и специфичностью применяемых методов, недостатками организационного характера, человеческим фактором и т. д. Именно поэтому при любом клиническом подозрении на заболевание пациента необходимо вновь обследовать по полной программе.
Неонатальный скрининг (НС) на тяжёлое заболевание муковисцидоз (МВ) уже проводился в Европе в начале 70-х годов прошлого столетия, однако это были всего лишь первые попытки. Данные исследования включали в себя проведение анализа мекония на содержание в нём альбумина. В 1979 году в плазме крови новорожденных научились определять уровень иммунореактивного трипсина (ИРТ), который при муковисцидозе повышается. Это событие стало отправным пунктом для дальнейших исследований в деле ведения массового скриннинга новорожденных на наличие муковисцидоза.
Когда было проведено первое клонирование гена CFTR в 1989 году, возможности НС резко расширились. Стало возможным включить анализ ДНК в протоколы скрининга МВ.
Данные о неонатальном скрининге в мире
В Европе было проведено обследование у 1,6 млн. новорожденных, из которых было выявлено 400 малышей, у которых имелись симптомы муковисцидоза .
За 2008 год число прошедших скрининг детей увеличилось почти вдвое. Это увеличение связано с внедрением НС в Великобритании и России. Данная программа полностью себя оправдала не только в медицинской составляющей, но и в экономической.
При возможности раннего определения заболевания можно начать ранее лечение, что приводит в дальнейшем к улучшению качества жизни больных и прогноза заболевания. Внедрение НС и генотипирования по гену CFTR привело к возможности раннего планирования семьи с учётом отягощённого генофонда.
Варианты НС
В европейских странах существует около 26 вариантов НС, которые состоят из 2-4 этапов. Первый этап везде это измерение уровня иммунореактивного трипсина в крови на первой неделе жизни новорожденного. Признак очень чувствительный, но специфичность его недостаточна, так как повышение ИРТ встречается ещё и при конъюгационной желтухе, перинатальном стрессе, атрезии кишечника, почечной недостаточности. Причём уровни ИРТ повышены у североамериканцев и афроамериканцев по сравнению с жителями Европы.
Второй этап необходим для повышения специфичности. Не представляется возможным в обществе, где вместе существует огромное число национальностей определить пациентов с мутировавшими генами путём определения ИРТ/ДНК.
Другим, альтернативным методом второго этапа является нахождение связанного с панкреатитом белка (РАР) в единообразном виде либо в комбинации с ИРТ. Данный подход сможет помочь в избегании проблем, в связи с выявлением и анализом CFTR–мутаций. На данный момент имеется разработанный комбинированный способ: набор для определения и оценки РАР+ИРТ. Проведение исследований только планируется.
Вышеописанные программы нужно комбинировать и они должны применяться у родственников с отягощённой патологией и в популяции в общем, потому как братья и сёстры больных муковисцидозом могут содержать в половине случаев рецессивный ген, то есть являться носителями.
Негативные аспекты НС
При получении положительного результата на МВ, необходимо проводить немедленную терапию. Именно в первый период осознания родители могут волноваться и очень сомневаться по поводу наличия у их ребёнка МВ. Если между полученными данными скрининга и окончательным диагностическим подтверждением проходит мало времени, данная ситуация психологически благоприятно сказывается на состоянии родителей маленького пациента, что способствует скорейшему началу адекватной терапии и развитию доверительных отношений между ними и врачом.
Эти отношения нередко тяжело налаживаются, а иногда и невозможны. При НС есть вероятность появления ложноположительных тестов. Таким образом, задачей учёных ставится определение как можно меньшего процента ложноположительных тестов.
Протокол НС в России
- ИРТ 2;
- Потовая проба;
- ДНК-диагностика.
С 2007 года НС на МВ веден как обязательное мероприятие для выявления тяжёлых наследственных заболеваний, в которые входят фенилкетонурия, гипотиреоз, галактоземия, адреногенитальный синдром.
Стоимость анализа в России высока (около 100$), поэтому проводится НС достаточно редко.
Потовая проба
В основном в медицинских центрах Европы проводят потовые пробы на наличие хлоридов. В России имеют регистрацию две системы для определения хлоридов в потовой жидкости. Это непрямой метод определения данных веществ.
Системы для сбора и анализа пота
Успешно у детей первых месяцев жизни используется система Macroduct с анализатором пота Sweat–Chek американского производства. Анализ можно проводить с её помощью вне лабораторных условий в течение 30 минут.
Также используется аппарат Nanoduct, который оснащён системой для стимуляции потоотделения посредством электрофореза раствора пилокарпина 0,1% и анализатором потовой проводимости.
Для анализа необходимо от 3 до 6 мкл пота. Поэтому данный аппарат очень широко используется в качестве технического оснащения для массового скрининга. Положительными считаются результаты 80 ммоль/л. Показатели пограничные - 60-80 ммоль/л.
Данные обследований
За три года исследований более 4 млн. новорожденных прошли НС на муковисцидоз у детей . Из всех обследованных выявлено 416 малышей с признаками МВ. Таким образом, частота встречаемости в Росси составляет 1:10000 новорожденных.
Повторных исследований часто не проводят детям с положительными тестами (с повышенным уровнем ИРТ), потому как родители отказываются от дальнейших исследований.
Диспансеризация новорожденных
При выявлении патологии малыши наблюдаются у врачей каждые 2 недели в течение 3 месяцев, затем каждый месяц следующие полгода, после чего каждые 2 месяца до 1 года, а с года каждый квартал.
Важным является наблюдение за пациентами без каких-либо проявлений болезни. Проводят копрологическое исследование каждый месяц до 1 года, определяют панкреатическую эластазу дважды за первый год жизни, общий анализ крови. При развитии обострения патологического процесса обследование необходимо провести более глубокое и тщательное.
Лечение муковисцидоза
Терапевтические мероприятия начинаются с момента диагностирования заболевания. Объём терапии будет зависеть от клинических проявлений и широты поражений органов. У подавляющего большинства пациентов все симптомы возникают на 1-ом году жизни и в 1-ый месяц жизни.
Для новорожденных применяют кинезиотерапию с использованием массажа, вибрации, поглаживания, занятий на мяче. Малышу все занятия должны быть приятны.
При присоединении бронхиальной обструкции показаны бронходилятаторы и муколитики.
Если есть проявления диспепсии, назначаются ферменты в качестве заместительного лечения и жирорастворимых витаминов.
Заключение
Оценить значение неонатального скрининга на муковисцидоз в России можно будет спустя несколько лет. При этом государство должно понимать важность данных мероприятий и всячески улучшать условия для их проведения.
Е.И. Кондратьева, д. м. н., профессор, В.Д. Шерман, к. м. н., Н.И. Капранов, д. м. н., профессор, Н.Ю. Каширская, д. м. н., профессор, НКО муковисцидоза ФГБНУ «МГНЦ», ГБУЗ «ДГКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова ДЗМ», г. Москва
Муковисцидоз (МВ), или кистозный фиброз (cysticfibrosis), - одно из наиболее частых моногенных наследственных заболеваний с полиорганной патологией, резко сокращающее продолжительность и качество жизни пациентов без адекватного комплексного лечения в течение всей жизни. МВ распространен среди населения всей Земли, но наиболее часто поражает европеоидов: в среднем с частотой 1 на 2500-4500 новорожденных. Еще совсем недавно больные муковисцидозом умирали в раннем детском возрасте или даже на первом году жизни от пневмонии и истощения, обусловленными мальабсорбцией.
Ключевые слова:
диагностика, генетика, мутации, неонатальный скрининг, потовая проба, эластаза кала.
Key words:
cystic fibrosis, diagnosis, genetics, mutation, newborn screening, sweat test, fecal elastase.
Болезнь прежде всего характеризуется повышенной продукцией вязкого бронхиального секрета, частыми легочными инфекциями и обструкцией дыхательных путей. По мере прогрессирования легочной болезни образуются участки ателектазов, развивается эмфизема, постепенно разрушается паренхима легких с развитием бронхоэктазов и участков пневмосклероза, а больной имеет высокий риск погибнуть от легочно-сердечной недостаточности. В финальной стадии заболевания пересадка комплекса «сердце-легкие» остается для больного единственной надеждой. Помимо бронхолегочной системы у большинства больных муковисцидозом поражается поджелудочная железа, при этом это происходит внутриутробно. Недостаточность панкреатических ферментов обусловливает нарушение всасывания жиров и белков, развитие нутритивной недостаточности. В результате больные отстают в росте и страдают гипотрофией. Продукция инсулина также может быть нарушена, что ведет к развитию диабета. К частым осложнениям течения муковисцидоза относят остеопороз, а также жировой гепатоз с переходом в цирроз. При наличии «мягкой» мутации клинические проявления развиваются постепенно, преобладают моносимптомы, диагноз «муковисцидоз» устанавливается поздно или случайно.
Своевременная диагностика муковисцидоза, обеспечивающая в большинстве случаев раннее начало терапии, в том числе на доклиническом этапе, улучшает прогноз заболевания, повышает эффективность лечения, позволяет предупредить развитие тяжелых осложнений, значительного отставания в физическом развитии, а в ряде случаев и необратимых изменений в легких. Ранняя диагностика позволяет семье вовремя решить необходимые вопросы, связанные с рождением здорового ребенка (генетическое консультирование, пренатальная диагностика МВ в последующие беременности).
Диагностика делится на:
1) пренатальную диагностику;
2) диагностику по неонатальному скринингу (до клинических проявлений или при их дебюте);
3) диагностику при клинических проявлениях:
4) диагностику среди родственников больных.
В настоящее время налаживается дородовая диагностика муковисцидоза в перспективных и информативных семьях (Москва, Санкт-Петербург, Уфа, Томск, Красноярск, Ростов-на-Дону, Владивосток и некоторые другие города), что, безусловно, важно для профилактики этой тяжелой патологии. Пренатальная диагностика возможна в виде ДНК-диагностики при проведении амниоцентеза (получение околоплодных вод в ранний срок -13-14 недель и поздний - обычно 16-20 недель беременности) в семье носителей одной мутации гена CFTR и имеющей больного ребенка. Диагноз может быть заподозрен при УЗИ плода внутриутробно при наличии характерной УЗ-характеристики в виде гиперэхогенного кишечника. УЗИ во время беременности рекомендуют в скрининговые сроки: 11-14, 18-21 и 30-34 недели беременности. Обязательно проводят повторное исследование. В 50-78% случаев это состояние будет связано с МВ и проявится мекониальным илеусом. Диагноз в этом случае может быть установлен еще до рождения ребенка. В то же время этот признак не является высокоспецифичным для МВ, может быть транзиторным явлением, а также связанным с другими патологическими состояниями. При этом ДНК-диагностика родителей дает необходимую информацию о наличии мутаций у каждого из родителей и позволяет предполагать заболевание у ребенка при рождении.
Клинические признаки
1. Диагностика классической формы МВ обычно не представляет сложностей. Классический фенотип больного является результатом наличия двух мутантных копий гена муковисцидозного трансмембранного регулятора (CFTR) и характеризуется хронической бактериальной инфекцией дыхательных путей и придаточных пазух носа, стеатореей из-за внешнесекреторной недостаточности поджелудочной железы, мужским бесплодием из-за обструктивной азооспермии, а также повышенной концентрацией хлоридов потовой жидкости.
2. Проблемы диагностики МВ, как правило, связаны с фенотипическим разнообразием его форм, обусловленным генетическим полимор-
В ряде случаев атипичного течения МВ возможна его диагностика во взрослом возрасте. Как правило, в этой группе больных отмечается более мягкое течение болезни в связи с сохранностью функции поджелудочной железы и нетяжелым поражением органов дыхания.
В абсолютном большинстве случаев МВ может быть диагностирован в раннем детском возрасте (в 90% случаев - на первом году жизни). К сожалению, нередки случаи диагностики МВ у взрослых с классическим фенотипом.
Диагностика МВ у носителей «мягких» генотипов (актуально для детей, рожденных до 2006-2007 гг., и взрослых):
В настоящее время выделяют несколько групп риска по МВ.
Основной группой риска по заболеванию в РФ в настоящее время являются новорожденные с неонатальной гипертрипсиногенемией. Учитывая возможность получения ложноотрицательных результатов неонатального скрининга, а также то обстоятельство, что в РФ неонатальный скрининг на МВ проводится с 2006-2007 гг., не теряет своей актуальности анализ групп риска, включающих пациентов с патологией желудочно-кишечного тракта, бронхолегочными нарушениями, патологией других органов и родственников больных МВ (табл. 1).
Таблица 1.
Группы риска для дифференциальной диагностики муковисцидоза
| I. Бронхолегочные нарушения |
| 1. Повторные и рецидивирующие пневмонии с затяжным течением, особенно двусторонние 2. Бронхиальная астма, рефрактерная к традиционной терапии 3. Рецидивирующие бронхиты, бронхиолиты, особенно с высевом Ps. aeruginosa 4. Двусторонние бронхоэктазы |
| II. Изменения со стороны желудочно-кишечного тракта |
| 1. Синдром нарушенного кишечного всасывания неясного генеза 2. Мекониальный илеус и его эквиваленты 3. Гиперэхогенность кишечника плода 4. Желтуха обструктивного типа у новорожденных с затяжным течением 5. Цирроз печени 6. Сахарный диабет 7. Гастроэзофагеальный рефлюкс 8. Выпадение прямой кишки |
| III. Патология со стороны других органов |
| 1. Нарушение роста и развития 2. Задержка полового развития 3. Мужское бесплодие 4. Хронический синусит 5. Полипы носа 6. Электролитные нарушения |
| IV. Члены семей больных муковисцидозом |
Среди клинических проявлений, характерных для МВ, можно выделить высоко-и менее специфичные (табл. 2). Состояния, представленные в левой колонке таблицы, в абсолютном большинстве случаев встречаются у больных МВ. Причиной состояний из правой колонки могут быть другие заболевания, например первичная цилиарная дискинезия, гуморальный иммунодефицит и т. д.
Таблица 2.
Клинические проявления, характерные для МВ
| Высокоспецифичные для МВ | Менее специфичные для МВ |
| Желудочно-кишечные: | Желудочно-кишечные: |
| | Со стороны дыхательных путей: |
| Другое: | Другое: |
В таблице 3 представлены особенности проявлений МВ в разные возрастные периоды. Знание этих особенностей помогает специалистам, наблюдающим пациента с теми или иными симптомами, включить МВ в перечень заболеваний для дифференциальной диагностики. Особенно это касается детей раннего возраста, когда клиническая картина еще может быть неполной, но на себя будут обращать внимание некоторые проявления, например мекониальный илеус при рождении или синдром потери солей, не имеющий связи с патологией почек. Диагноз в этом случае может быть установлен еще до рождения ребенка. В то же время этот признак не является высоко специфичным для МВ, может быть транзиторным явлением, а также связанным с другими патологическими состояниями.
Таблица 3.
Клинические особенности проявлений МВ в различные возрастные периоды
| 0-2 года | |
|
|
|
| 3-16 лет | |
|
|
|
Диагностические критерии МВ
Для решения проблем диагностики МВ, в том числе и его атипичных форм, были разработаны критерии, согласно которым обязательным для МВ является наличие характерного клинического синдрома плюс доказательство какого-либо нарушения функции хлорного канала.
Учитывая все научные достижения в понимании природы муковисцидоза и МВ-зависимых заболеваний за последние 10 лет, в 2013 году группа экспертов Европейского общества муковисцидоза (European Cystic Fibrosis Society) под руководством Carlo Castellani подготовила новые стандарты диагностики в редакции Alan R. Smyth и Scott Bell (схема).
Схема.
Диагностические критерии муковисцидоза ECFS 2013
Неонатальный скрининг
Проводится на основании Методических рекомендаций по проведению неонатального скрининга в РФ с использованием Европейских рекомендаций по неонатальному скринингу. 90% новорожденных без клинических проявлений муковисцидоза диагноз может быть установлен на основании скрининга в возрасте до 6 недель. В 5-10% случаев возникают трудности с диагностикой муковисцидоза (Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry, 2005 Annual Data Report to the Center Directors. Bethesda, MD: CFF).
Проблемы неонатального скрининга:
Потовая проба
Показания:
1. При положительном результате неонатального скрининга (двукратном повышении уровня иммунореактивного трипсиногена в крови в течение первого месяца жизни ребенка).
2. При наличии у пациента каких-либо характерных клинических проявлений МВ.
3. Случаи МВ в семье.
Потовая проба является надежным методом диагностики МВ у 98% больных. Исследование можно проводить всем детям через 48 часов после рождения, хотя у новорожденных могут быть проблемы с набором пота. Несмотря на то, что «золотым стандартом» диагностики МВ считается количественное определение хлоридов в потовой жидкости (классический метод Гибсона - Кука), метод определения проводимости на аппаратах «Макродакт» и «Нанодакт» («Вескор», США) показал хорошую с ним корреляцию в многочисленных исследованиях.
Оценка результата
При положительном результате потовой пробы (хлориды > 60 ммоль/л при классическом методе Гибсона - Кука и/или проводимость > 80 ммоль/л NaCl) диагноз подтверждается.
Генетическое исследование
Генетическое исследование проводится после потовой пробы. Однако в связи с ограниченными возможностями ДНК-диагностики в России данный метод не является обязательным, однако применяется с исследовательской целью и для окончательного подтверждения диагноза.
На первом этапе ДНК-обследования наиболее часто используется панель, включающая 28 мутаций, как наиболее частых в мире, так и специфичных для России: F508del, CFTRdele2,3(21kb), 3849+10kbC>T, W1282X, 2143delT, 2184insA, 1677delTA, N1303K, G542X, R334W, E92K, L138ins, 394delTT, 3821delT, S1196X, 2789+5G>A, G85E, 2183AA>G, 604insA, 621+1G>T, R117H, R347P, R553X, 3667insTCAA, G551D, I507del, 1717-1G>A, 2184delA. По данным лаборатории генетической эпидемиологии ФГБУ «Медико-генетический научный центр» (МГНЦ) РАМН, при использовании данной панели удается обнаружить лишь около 82,5% мутантных аллелей у больных МВ. В случае когда при положительной потовой пробе не будет найдено ни одной мутации гена (что само по себе маловероятно), может потребоваться секвенирование гена МВ, позволяющее идентифицировать примерно 98% мутаций в гене CFTR.
1. На основании данных национального регистра больных МВ по ДНК-диагностике гена CFTR установлены особенности характера и частоты мутаций в регионах страны. На основе данных регистра рекомендуется создание региональных рекомендаций по определению мутаций со ссылкой на регистр (последнюю версию).
2. Отсутствие мутациий без проведения секвенирования - недостаточно для исключения МВ.
3. Некоторые мутации МВТР (3849+10 kb C>T) ассоциированы с нормальным или пограничным результатом потового теста.
4. «Мягкие» мутации характеризуются поздним дебютом заболевания, пограничным значением потовых проб, выявляются чаще при секвенировании.
5. Пациенты с пограничными результатами потовых проб (хлориды 30-60 ммоль/л и/или проводимость 50-80 ммоль/л), единственной мутацией гена представляют реальные трудности для диагностики.
Для диагностики МВ или его исключения при пограничных результатах пробы необходимо:
В европейских странах для подтверждения дефекта ионного транспорта применяется метод определения разности назальных потенциалов или измерение электрического тока в биоптате кишки, отражающие нарушение функции хлорного канала. Оба метода основаны на электрическом характере транспорта ионов и являются высокоинформативными для диагностики МВ.
Диагностика панкреатической недостаточности включает:
У больных МВ показатель эластазы может снижаться в течение первых лет жизни, поэтому определяется в динамике. Низкий уровень панкреатической эластазы расценивается как один из признаков МВ. Приблизительно 1% пациентов с МВ имеет пограничный результат потового теста в комплексе с сохранной функцией поджелудочной железы и хроническим бронхитом.
Диагностика хронического бронхолегочного процесса:
В качестве дополнительных диагностических маркеров могут быть использованы азооспермия в постпубертатном возрасте, идентификация МВ-ассоциированных патогенов из респираторного тракта, рентгенологические признаки синусита.
Знание основных симптомов МВ и особенностей его течения в разные возрастные периоды позволяет своевременно заподозрить наличие заболевания и направить пациента для дальнейшего обследования. Нередкие случаи поздней диагностики МВ связаны как с отсутствием у врачей достаточных знаний о заболевании, так и с фенотипическим разнообразием его форм. Ограниченные возможности ДНК-диагностики МВ в России и ее низкая доступность затрудняют и затягивают окончательную верификацию заболевания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Муковисцидоз. Под ред. Н.И. Капранова, Н.Ю. Каширской. М.: ИД «МЕДПРАКТИКА-М», 2014, 672 с. ISBN 978-5-98803-314-1
2. Welsh M.J., Ramsey B.W., Accurso F.J., Cutting G.R. Cystic fibrosis. In: Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D., eds. The metabolic and molecular bases of inherited disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill, 2001: 5121-88.
3. European cystic fibrosis society standards of care working group. Best practice guidelines. В редакции Alan R. Smith и Scott Bell, 2014.
4. Farell P.M., Rosenstein B.J., White T.B. et al. Cystic fibrosis foundation. Guidelines for diagnosis of cystic fibrosis in newborns through older adults: Cystic Fibrosis Foundation consensus report // J. Pediatr., 2008; 153 (2): S4-S14.
5. Красовский С.А., Каширская Н.Ю., Усачева М.В., Амелина Е.Л., Черняк А.В., Науменко Ж.К. Влияние возраста постановки диагноза и начала специфической терапии на основные клинико-лабораторные проявления заболевания у больных муковисцидозом // Вопросы современной педиатрии, 2014, т. 13, № 2, с. 36-43.
6. de Boeck K., Wilschanski M., Castellani C. et al. Cystic fibrosis: terminology and diagnostic algorithms. Thorax, 2006; 61: 627-635.
7. de Oronzo M.A. Hyperechogenic fetal bowel: an ultrasonographic marker for adverse fetal and neonatal outcome? // J. Prenat. Med., 2011 Jan-Mar; 5 (1): 9-13.
8. Bombieri C. et al. Recommendations for the classification of diseases as CFTR-related disorders // Journal of Cystic Fibrosis, 2011, vol. 10, suppl. 2; S86-S102.
9. Hall E., Lapworth R. Use of sweat conductivity measurements. Annals of Clinical Biochemistry, 2010; 47: 390-392.
10. Sands D., Oltarzewski M., Nowakowska A., Zybert K. Bilateral sweat tests with two different methods as a part of cystic fibrosis newborn screening (CF NBS) protocol and additional quality control. Folia Histochem Cystobiol., 2010 Sep 30; 48 (3): 358-65.
11. Sezer R.G., Aydemir G., Akcan A.B. et al. Nanoduct sweat conductivity measurements in 2664 patients: relationship to age, arterial blood gas, serum electrolyte profiles and clinical diagnosis // J. Clin. Med. Res., 2013 Feb; 5 (1): 34-41.
12. Петрова Н.В. Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза в российских популяциях. Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., 2009, 42 с.
13. Derichs N., Sanz J., Von Kanel T. et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax, 2010 Jul; 65 (7): 594-9.
14. Servidoni M.F., Sousa M., Vinagre A.M. et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC Gastroenterol., 2013 May 20; 13 (1): 91.
Одним из важных методов ранней диагностики муковисцидоза, определяющий своевременное начало терапии, увеличение продолжительности и улучшению качества жизни больных, является массовый скрининг новорожденных. В мире неонатальный скрининг на муковисцидоз успешно проводится более тридцати лет. Как показал многолетний опыт, активное диспансерное наблюдение и своевременное комплексное лечение вновь выявленных больных, позволяют предотвратить или, по крайней мере, замедлить развитие осложнений.
По сравнению с больными, диагностированными по симптомам заболевания в более позднем возрасте, для выявленных при неонатальном скрининге характерно хорошее самочувствие. К трем годам отмечены достоверно меньшие изменения в легких, меньшая частота обострений бронхолегочного процесса, более редкая частота высева патогенной микрофлоры. Наблюдается также значимо меньшая частота декомпенсации кишечного синдрома, лучшие показатели физического статуса, включая массо-ростовой индекс.
С июня 2006 года в ряде регионов РФ, а с 2007 года по всей России проводится скрининг новорожденных на муковисцидоз. Обследование состоит из 4х этапов, три из которых обязательны.
- Первый этап - проводится всем детям. У новорожденных берут каплю крови на 4-5й день жизни (у недоношенных на 7-8й день), и в высушенном пятне крови определяется содержание иммунореактивного трипсина (ИРТ). Нормальное значение: не более 65-70 нг/мл (в зависимости от используемых в данной лаборатории реактивов).
- Второй этап - у детей с повышенным уровнем ИРТ (>70 нг/мл) повторное определение ИРТ в крови проводят на 4 неделе жизни (с 21 по 28 день жизни строго). У здоровых детей показатель не превышает 40 нг/мл .
Повышение уровня ИРТ у новорожденных бывает не только при муковисцидозе, но и при ряде врожденных и наследственных патологий, таких как: внутриутробная гипоксия плода, внутриутробные инфекции, перинатальный стресс, незрелость плода, коньюгационная желтуха новорожденных, хромосомные перестройки и др., а также гетерозиготное носительство мутаций в гене CFTR, как следствие функциональной недостаточности поджелудочной железы. Поэтому для подтверждения диагноза МВ при положительных результатах 2го теста ИРТ (>40 нг/мл), а также при несоблюдении сроков проведения 2го теста (21-28 день) необходимо обязательно проводить потовую пробу. И наоборот, при некоторых состояниях (у недоношенных детей, при мекониальном илеусе, при вирусных инфекциях, после переливаний крови) возможно получение ложноотрицательных результатов. То есть диагноз МВ впоследствии может быть поставлен и при отрицательных результатах скрининга.
- Третий этап. Потовая проба, проводится детям с положительными результатами определения ИРТ. Нормальные значения: до 50 ммоль/мл.
Если результаты потовой пробы не превышают 50 ммоль/л, за развитием ребенка наблюдают по месту жительства, повторная консультация проводится в 1 год.
- Четвертый этап. При пограничном результате потовой пробы (40-60 ммоль/л по методу Гибсона-Кука или 60-80 ммоль/л (Нанодакт)) проводится ДНК-диагностика на 20 наиболее распространенных в РФ мутаций МВ.
Если мутаций не выявлено, то ребенок в течение года наблюдается в ближайшем центре муковисцидоза, необходимо провести исследование содержания эластазы 1 в кале, провести повторные потовые пробы.
При положительном результате потовой пробы (>60 ммоль/л по методу Гибсона-Кука или >80 ммоль/л при определении проводимости пота на аппарате Нанодакт) диагноз МВ считается подтвержденным. Ребенок наблюдается в центре муковисцидоза.
Литература:
1. В.Д. Толстова, Н.Ю. Каширская, Н.И. Капранов. Массовый скрининг новорожденных на муковисцидоз в России. Фарматека № 1 - 2008
