При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные АГ и митогены.

В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.

РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.

Торможение гемагглютинации РТГА применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применѐнным AT.

Прямая иммунофлюоресценция.

Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 недели, а при использовании меченых моноклональных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать несвязавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).

Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.

Выявление противовирусных антител (AT) в сыворотке крови. РТГА. РСК. РИФ.

Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител.

Более простой и доступный подход - выявление противовирусных антител (AT) в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2~3 недели. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период реконвалесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.

Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать антитела (AT), образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую - в период выздоровления (через 2-3 недели). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований. РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа).

Метод позволяет легко выявлять подобные антитела (AT) в сыворотке больного. РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.

РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции.

Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца. Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный АГ сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации несвязавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наибольшее распространение нашёл метод иммуноблотинга.

Выявление вирусных антигенов (АГ). ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления АГ некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления АГ на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую АГ; после инкубирования несвязанный АГ декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы. Гибридизация ДНК - высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы.

Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпштейна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Основан на определении в крови больного противовирусных антител в сероло­гических реакциях с использованием специфических вирусных ан­тигенов - диагностикумов или специальных тест-систем. Серологические реакции при вирусных инфек­циях ставят в жидкой среде (РСК, РТГА, РНГА, РОНГА, РТОНГА, РИА), в геле (РПГ, РРГ, РВИЭФ) или на твердофазном носителе (например, на стенках лунки полистиролового планшета с фиксацией на них од­ного из компонентов иммунной реакции – антигена или антитела). Известны такие твердофазные методы как ИФА, ИЭМ, РГадсТО, РИФ, РГадс, РТГадс.

Нередко, вследствие наличия в крови большинства здоровых людей естественных противовирусных антител, серологическая диагностика вирусных инфекций основывается на исследовании парных сыво­роток, взятых в начале и в разгаре болезни или в периоде реконвалесценции с целью определения нараста­ния титра антител. Диагностически значимым считается нарастание титра антител в четыре раза и более.

Повышение чувствительности серологических методов достигается адсорбцией антигенов или антител на эритроцитах (РНГА, РОНГА, РТОНГА, РГадсТО, РРГ), меткой ферментами (ИФА), радиоактивными изотопами (РИА, РПГ) или флюорохромами (РИФ), Используется также прин­цип лизиса эритроцитов (как индикаторной системы) при взаимодействии антигенов и анти­тел в присутствии комплемента (РСК, РРГ).

Реакция связывания комплемента (РСК) в виде варианта связывания комплемента на холоде (в течение ночи при температуре +4 0 С) часто применяетсяв вирусологии для ретроспективной диагностики ряда вирусных инфекций и для определения вирус-специфических антигенов в материалах от больных.

Реакция радиального гемолиза (РРГ) в агарозном гелеоснована на явлении гемолиза эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, под влиянием вирусспецифических антител в присутствии комп­лемента и применяется для сероло­гической диагностики гриппа, ОРВИ, краснухи, паротита, тогавирусных инфекций.

Для постановки реакции к бараньим эритроцитам (0,3 мл 10%-й суспензии) добавляют 0,1 мл неразведенного вирусного антигена и смесь выдерживают 10 мин при комнатной температуре. К 1,2% агарозе при температуре 42 0 С добавляют 0,3 мл сенсибилизи­рованных эритроцитов и 0,1 мл комплемента, смесь разливают на предметные стек­ла или в лунки полистироловых планшетов, в зас­тывшем геле агарозы с помощью пробойника вырезают отверстия и заполняют их исследуемыми и контрольной сыворотками. Стекла или панели закрывают крышкой и помещают их во влажной камере на 16-18 часов в термостат. Учет реакции осуществляют по диаметру зоны гемолиза вок­руг отверстий, заполненных сывороткой. В контроле гемолиз отсутствует.

Антигены – генетически чужеродные вещества, которые при введении в организм животного или человека вызывают специфический иммунный ответ - синтез антител, формирование сенсибилизированных Т-лимфоцитов, иммунологической памяти или толерантности. Под чужеродными веществами понимаются химические структуры, которых нет в организме. Инородными для организма человека являются вирусы, микроорганизмы, а также клетки, ткани, органы животных и других людей. Антигены имеют несколько рецепторов для связи с антителами и способны вступать в реакцию с ними как в организме животного или человека (in vivo), так и вне организма – в пробирке (in vitro).

Антитела - высокомолекулярные белки глобулиновой фракции сыворотки крови. Антитела синтезируются под влиянием антигена и способны специфично реагировать (соединяться) с соответствующим антигеном. Все антитела имеют характерную структуру иммуноглобулинов; отличаются по иммунологическим, биологическим и физическим свойствам; и делятся на 5 классов – ІgG , ІgА, ІgМ, ІgD и ІgЕ.

Серологические реакции

В лабораторной практике используют серологические реакции - лабораторные реакции между антигенами и антителами, которые приводят к регистрируемым изменениям в исследуемой системе. Эти реакции получили название серологических, так как для их постановки используют сыворотку (serum), содержащую антитела.

Серологические исследования, выполняемые для обнаружения специфических антител и антигена возбудителя при инфекционных заболеваниях, - более доступные методы лабораторной диагностики, чем бактериологическое выявление возбудителя. В ряде случаев серологические исследования остаются единственным методом диагностики инфекционных заболеваний.

Некоторые методы определения антител, используемые в лабораторной практике

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунных комплексов, которые можно обнаружить в тестах in vitro (т.е. «в пробирке» - вне живого организма). Реакции антиген-антитело в системе in vitro могут сопровождаться возникновением нескольких феноменов - агглютинации, преципитации, лизиса и других. Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размеры частиц, физическое состояние), класса и вида антител, а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).

1. Реакция связывания комплемента

Комплемент - это система белков плазмы крови, которая включает в себя 9 компонентов указанных буквой С (С1, С2, С3,... С9), фактор В, фактор D и ряд регуляторных белков. Некоторые из этих компонентов состоят из 2 - 3 белков, например С1 - это комплекс из трех белков. Эти белки циркулируют в кровеносном русле и присутствуют на мембранах клеток. Комплемент является важнейшей системой как врождённого, так и приобретённого иммунитета. Эта система предназначена для защиты организма от действия чужеродных агентов и участвует в реализации иммунного ответа организма. Комплемент был открыт в конце 19-го столетия бельгийским ученым Ж. Борде.

Реакция связывания комплемента (РСК) – серологическая реакция, используемая для количественного определения комплементсвязывающих антител и антигенов. Впервые описана Борде и Жангу (Bordet - Gengou) в 1901 году. РСК основана на том, что комплекс "антиген - антитело" способен поглощать комплемент, который добавляют в реакционную смесь. При соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент. Специфический иммунный комплекс адсорбирует комплемент, добавленный в систему, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Чем больше антител, тем больше фиксируется комплемента. Если же комплекс "антиген - антитело" не образуется, то комплемент остается свободным.

Сложность РСК состоит в том, что реакция образования комплекса "антиген - антитело – комплемент" невидимая. Для выявления компонентов реакции используют дополнительную индикаторную гемолитическую систему. С помощью реакции гемолиза проводится количественное определение остатка комплемента после окончания реакции антигена с антисывороткой.

Реакцию связывания комплемента (РСК) используют для выявления антител на определенный антиген или определяют тип антигена по известному антителу. В этой сложной серологической реакции участвуют две системы и комплемент. Первая система - бактериологическая (основная), состоит из антигена и антитела. Вторая система - гемолитическая (индикаторная). В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело).

РСК ставят в два приема: вначале соединяют антиген с испытуемой сывороткой крови, в которой отыскивают антитела, а затем добавляют комплемент. Если антиген и антитело соответствуют друг другу, то образуется иммунный комплекс, который связывает комплемент. При отсутствии в сыворотке антител иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Поскольку процесс адсорбции комплемента комплексом визуально невидимый, то для выявления этого процесса добавляют гемсистему.

В связи с высокой чувствительностью реакция связывания комплемента (РСК) применяется как для серологической диагностики бактериальных и вирусных инфекций, аллергических состояний, так и для идентификации антигенов (выделенной бактериальной культуры).

Реакция преципитации (РП) (от лат. praecipitatio – выпадение осадка, падение вниз) основана на выпадении в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена и специфического антитела в присутствии электролита. В результате реакции образуется мутное кольцо или рыхлый осадок – преципитат. Реакция преципитации происходит между водорастворимым антигеном и антителом, получаются крупные комплексы, которые выпадают в осадок

3. Реакция флоккуляции

Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат floccus - хлопья шерсти, flocculi – клочья, хлопья; flocculation – образование рыхлых хлопьевидных агрегатов (флокул) из мелких частиц дисперсной фазы) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин - антитоксин или анатоксин – антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Реакция флокуляции основана на выявлении «инициальной» флокуляции - помутнения при образовании комплекса экзотоксин (анатоксин) + антитоксин в оптимальных количественных соотношениях ингредиентов.

4. Реакция агглютинации

Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) – это реакция взаимодействия антигена со специфическим антителом, которая проявляется в виде склеивания. При этом антигены в виде частиц-корпускул (микробные клетки, эритроциты и др.) склеиваются антителами и выпадают в осадок (агглютинат) в виде хлопьев. Агглютинаты обычно видны невооруженным глазом. Для появления реакции необходимо присутствие электролитов (например, изотонического раствора хлорида натрия), ускоряющих процесс агглютинации.

С помощью реакции агглютинации (РА), reactio agglutinationis (англ. agglutination test) выявляют антитела или корпускулярные антигены. В зависимости от вида используемого иммунодиагностикума различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латексагглютинации, коаглютинации и т.д.

5. Название антител, участвующих в осадочных реакциях

Антитела, участвующие в осадочные реакциях, получили традиционное название по своему взаимодействию с антигеном:

агглютинины – вызывают склеивание корпускулярного антигена – агглютиногена и осаждение комплекса антиген - антитела (агглютината);

преципитины – образуют преципитат с растворимым антигеном – преципитиногеном.

В лизирующих реакциях участвуют бактериолизины (вызывают лизис бактерий) и гемолизины (вызывают лизис эритроцитов).

11621 0

Серологические реакции обозначают в соответствии с феноменами, сопровождающими образование комплекса антиген — антитело при взаимодействии различных по свойствам компонентов. Различают реакции агглютинации, преципитации и лизиса.

Реакция агглютинации (РА)

Реакция агглютинации (РА) основана на применении корпускулярного антигена (взвесь бактерий, сенсибилизированных эритроцитов, частиц латекса и др.), взаимодействующего со специфическими антителами, в результате чего образующийся комплекс антиген - антитело выпадает в виде осадка. Эту реакцию широко применяют в лабораторной практике для серологической диагностики бактериальных инфекций и для идентификации выделенных микроорганизмов.

РА используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза (реакции Райта, Хеддльсона), туляремии, лептоспироза (РАЛ - реакция агглютинации и лизиса лептоспир), листериоза, сыпного тифа (РАР - реакция агглютинации риккетсий), шигеллеза, иерсиниоза, псевдотуберкулеза и др.

Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РИГА или РПГА).

Для постановки этой реакции используют эритроциты животных (барана, обезьяны, морских свинок, некоторых птиц), сенсибилизированных антителами или антигеном, что достигается инкубацией взвеси эритроцитов и раствора антигена или иммунной сыворотки.

Диагностикумы, полученные на основе эритроцитов, сенсибилизированных антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами . Они предназначены для определения антител в серийных разведениях сывороток крови, например эритроцитарные шигеллезные диагностикумы, эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы.

Соответственно диагностикумы на основе эритроцитов, сенсибилизированных специфическими иммуноглобулинами, называют антительными (иммуноглобулиновыми) диагностикумами и они служат для выявления антигенов в различном материале, например эритроцитарный иммуноглобулиновый дифтерийный диагностикум для РИГА, применяемый для выявления дифтерийного экзотоксина коринебактерий в жидкой питательной среде при посеве в нее материала из носа и ротоглотки.

Реакцию гемагглютинации применяют для диагностики как бактериальных (брюшной тиф, паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), так и вирусных (грипп, аденовирусные инфекции, корь и др.) инфекций. По чувствительности и специфичности РИГА превосходит РА.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют для титрования противовирусных антител в сыворотках крови, а также с целью установления типовой принадлежности выделенных вирусных культур. РТГА можно применить для диагностики тех вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.

Принцип метода состоит в том, что сыворотка, содержащая антитела к конкретному типу вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность и эритроциты остаются неагглютинированными.

Реакция торможения (задержки) пассивной гемагглютинации (РТПГА).

В РТПГА участвуют три компонента: иммунная сыворотка, антиген (исследуемый материал) и сенсибилизированные эритроциты.

Если в исследуемом материале есть антиген, специфически реагирующий с антителами иммунной стандартной сыворотки, то он связывает их, и при последующем добавлении эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, гомологичным сыворотке, гемагглютинация не наступает.

РТПГА применяют для обнаружения микробных антигенов, для количественного их определения, а также для контроля специфичности РПГА.

Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

В качестве носителя антител (иммуноглобулинов) используют частицы латекса. РЛА является экспресс-методом диагностики инфекционных болезней, учитывая время проведения (до 10 мин) и возможность обнаружить антиген в небольшом объеме исследуемого материала.

РЛА применяют для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типа b, Neisseria meningitidis в цереброспинальной жидкости, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, для диагностики сальмонеллеза, иерсиниозов и других заболеваний. Чувствительность метода составляет 1-10 нг/мл, или 10³ -10⁶ бактериальных клеток в 1 мкл.

Реакция коагглютинации (РКоА)

Реакция коагглютинации (РКоА) основана на способности белка А стафилококков присоединять специфические иммуноглобулины. РКА - метод экспресс-диагностики - служит для выявления растворимых термостабильных антигенов в секретах человека и в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Обнаружение специфических антигенов в составе ЦИК требует их предварительного осаждения из сыворотки крови.

Реакция преципитации

В реакции преципитации (РП) в результате взаимодействия антител с высокодисперсными растворимыми антигенами (белки, полисахариды) образуются комплексы с участием комплемента - преципитаты. Это чувствительный тест, используемый для выявления и характеристики разнообразных антигенов и антител. Простейшим примером качественной РП является образование непрозрачной полосы преципитации в пробирке на границе наслоения антигена на иммунную сыворотку - реакция кольцепреципитации. Широко применяют различные разновидности РП в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез).

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на феномене гемолиза с участием комплемента, т.е. способна выявлять только комплементсвязывающие антитела.

РСК широко применяют для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций, риккетсиозов, хламидиозов, инфекционного мононуклеоза, протозойных инфекций, гельминтозов. РСК является сложной серологической реакцией, в которой участвуют две системы: исследуемая (сыворотка крови), представленная системой антиген - антитело и комплементом, и гемолитическая (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). Гемолитическая сыворотка представляет собой инактивированную прогреванием сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Она содержит антитела против эритроцитов барана.

Положительный результат РСК - отсутствие гемолиза - наблюдают в случае, если в исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену. При этом образовавшийся комплекс антиген - антитело связывает комплемент, а в отсутствии свободного комплемента добавление гемолитической системы не сопровождается гемолизом. В случае отсутствия в сыворотке антител, соответствующих антигену, образования комплекса антиген - антитело не происходит, комплемент остается свободным и сыворотка вызывает гемолиз эритроцитов, т.е. наличие гемолиза - это отрицательный результат реакции.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.

Лабораторная диагностика

УДК -078

Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Н.Н. Носик, В.М. Стаханова

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва

Laboratory Diagnosis of Viral Infections

N.N. Nosik, V.M. Stachanova

Введение

Расширение возможностей в лечении и профилактике вирусных болезней с использованием противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и вакцин с различным механизмом действия нуждается в быстрой и точной лабораторной диагностике. Узкая специфичность некоторых противовирусных препаратов также требует быстрой и высокоспецифичной диагностики инфицирующего агента. Появилась необходимость в количественных методах определения вирусов для мониторинга противовирусной терапии. Помимо установления этиологии заболевания лабораторная диагностика имеет важное значение в организации противоэпидемических мероприятий.

Ранняя диагностика первых случаев эпидемических инфекций позволяет своевременно провести противоэпидемические мероприятия – карантин, госпитализацию, вакцинацию и пр. Реализация программ по ликвидации инфекционных заболеваний, например натуральной оспы, показала, что по мере их выполнения возрастает роль лабораторной диагностики. Существенную роль играет лабораторная диагностика в службе крови и акушерской практике, например, выявление доноров, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита В (HBV), диагностика краснухи и цитомегаловирусной инфекции у беременных.

Диагностические методы

В лабораторной диагностике вирусных инфекций имеются три основных подхода (табл. 1, табл. 2):

1) непосредственное исследование материала на наличие вирусного антигена или нуклеиновых кислот;

2) изоляция и идентификация вируса из клинического материала;

3) серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни.

При любом выбранном подходе к вирусной диагностике одним из важнейших факторов является качество исследуемого материала. Так, например, для прямого анализа образца или для изоляции вируса исследуемый материал должен быть получен в самом начале заболевания, когда возбудитель еще экскретируется в относительно больших количествах и не связан пока антителами, а объем образца должен быть достаточен для проведения прямого исследования. Также важен выбор материала в соответствии с предполагаемым заболеванием, то есть того материала, в котором исходя из патогенеза инфекции вероятность присутствия вируса наибольшая.

Не последнюю роль в успешной диагностике играет среда, в какую берется материал, как он транспортируется и как хранится. Так, носоглоточные или ректальные мазки, содержимое везикул помещают в среду, содержащую белок, предотвращающий быструю потерю инфекционности вируса (если планируется его изоляция), или в соответствующий буфер (если планируется работа с нуклеиновыми кислотами).

Прямые методы диагностики клинического материала

Прямые методы – это методы, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту (НК) непосредственно в клиническом материале, то есть являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако из-за ряда особенностей возбудителей прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.

Электронная микроскопия (ЭМ). С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно 1·10 6 частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя, как правило, в материале от больных незначительна, то поиск вируса затруднен и требует предварительного его осаждения с помощью высокоскоростного центрифугирования с последующим негативным контрастированием. Кроме того, ЭМ не позволяет типировать вирусы, так как у многих из них нет морфологических различий внутри семейства. Например, вирусы простого герпеса, цитомегалии или опоясывающего герпеса морфологически практически неотличимы.

Одним из вариантов ЭМ, используемым в диагностических целях, является иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), при которой применяются специфические антитела к вирусам. В результате взаимодействия антител с вирусами образуются комплексы, которые после негативного контрастирования легче обнаруживаются.

ИЭМ несколько более чувствительна, чем ЭМ, и используется в тех случаях, когда вирус не удается культивировать in vitro , например при поиске возбудителей вирусных гепатитов .

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой . В первом случае применяются меченные красителем антитела к вирусам, которые наносятся на инфицированные клетки (мазок, культура клеток). Таким образом, реакция протекает одноэтапно. Неудобством метода является необходимость иметь большой набор конъюгированных специфических сывороток ко многим вирусам.

При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносится специфическая сыворотка, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в материале, а затем наслаивается антивидовая сыворотка к гамма-глобулинам животного, в котором готовилась специфическая иммунная сыворотка, например антикроличья, антилошадиная и т. п. Преимущество непрямого варианта РИФ состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.

Метод РИФ широко применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей . Успешное применение РИФ для прямой детекции вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также -галактозидазу и -лактамазы . Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде нерастворимого осадка, и тогда учет проводится с помощью обычного светового микроскопа, или в виде растворимого продукта, который обычно окрашен (или может флюоресцировать или люминесцировать) и регистрируется инструментально.

Поскольку с помощью ИФА можно измерять растворимые антигены, то не требуется наличия интактных клеток в образце и таким образом могут использоваться различные виды клинического материала.

Другое важное преимущество метода ИФА – возможность количественного определения антигенов, что позволяет применять его для оценки клинического течения болезни и эффективности химиотерапии. ИФА, как и РИФ, может применяться как в прямом, так и в непрямом варианте.

Твердофазный ИФА, дающий растворимый окрашеный продукт реакции, нашел наибольшее распространение. ИФА может быть использован как для определения антигена (тогда на твердую фазу – дно лунки полистиролового планшета – наносятся антитела), так и для определения антител (тогда на твердую фазу наносятся антигены) .

Радиоиммунный анализ (РИА) . Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

Молекулярные методы. Первоначально классическим методом выявления вирусного генома считался высокоспецифичный метод гибридизации НК, но в настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитевых структур и на выявлении их с помощью метки. Для этой цели используются специальные ДНК- или РНК-зонды, меченные изотопом (32 Р) или биотином, обнаруживающие комплементарные нити ДНК или РНК. Существуют несколько вариантов метода: – точечная гибридизация – выделенную и денатурированную НК наносят на фильтры и затем добавляют меченый зонд; индикация результатов – авторадиография при использовании 32 Р или окраска – при авидин-биотине; – блот-гибридизация – метод выделения фрагментов НК, нарезанных рестрикционными эндонуклеазами из суммарной ДНК и перенесенных на нитроцеллюлозные фильтры и тестируемые мечеными зондами; используется как подтверждающий тест при ВИЧ инфекции; – гибридизация in situ – позволяет определять НК в инфицированных клетках .

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий вирусной ДНК в исследуемом материале. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций (вирусы гепатитов, герпеса, цитомегалии, папилломы и др.) .

Разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определять число копий амплифицированного сайта ДНК. Методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При цитомегаловирусной инфекции, например, в срезах ткани или в моче обнаруживаются характерные гигантские клетки– "совиный глаз", при бешенстве – включения в цитоплазме клеток (тельца Бабеша–Негри). В некоторых случаях, например при дифференциальной диагностике хронических гепатитов, имеет значение оценка состояния ткани печени.