Суставы

Гельминтологические методы. Лабораторная диагностика гельминтозов

7.7. Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов

Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы.

7.7.1. Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду

Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели она распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли, так называемые "нитки жемчуга".

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от их места нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина - 0,5 г, натрия бикарбоната - 0,09 г, дистиллированной воды - 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36 - 38 °С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6 - 8 часов в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1%-ный раствор натрия сульфида или 20%-ный раствор натрия гипохлорида, или же в 1%-ный раствор хлорной воды при 36 - 38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем "растворяются" в течение 10 минут - 2 часов. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1%-ного раствора натрия хлорида, 0,5%-ного раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36 - 38 °С.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня наиболее проста методика Иониной Н.С.: у живых яиц медианная пара эмбриональных крючьев или параллельна латеральным, или последние образуют с медианной угол у основания меньше 45°. У мертвых яиц латеральные пары образуют у основания угол с медианной парой больше 45° или же крючья беспорядочно разбросаны (утрачивается их парное расположение); иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5 - 10° до 38 - 40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых яиц нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3%-ный раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24 - 30 °С, яйца власоглавов в 3%-ном растворе соляной кислоты при температуре 30 - 35 °С; яйца остриц в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 37 °С. Чашки Петри следует открывать 1 - 2 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2 - 3 месяцев свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых дней развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, наливают осторожно на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1 - 2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25 - 30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5 - 7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом.

Яйца трематод, естественно развивающиеся в воде, например описторхисов, дифиллоботриид, фасциол и других, помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они развиваются быстрее в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22 - 24 °С через 9 - 12 суток формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету.

Метод Фюллеборна. Личинки анкилостомид и стронгилид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После выдерживания в термостате при температуре 25 - 30 °С в течение 5 - 6 часов личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий.

Метод Харада и Мори. В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15 х 150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Накрывают верхний конец куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер, фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят 8 - 10 суток при температуре 28 °С. Для изучения личинок снимают и удаляют целлофановую крышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 минут, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными таблицы 3.

Таблица 3

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ФИЛЯРИЕВИДНЫХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Личинки	Размеры	Характерные признаки
A. duodenale	Длина тела около 660 мкм, чехлика - 720 нм	Исчерченность чехлика менее выражена, ротовой выступ менее заметен, передний конец тела (но не чехлика) тупой, диаметр кишечной трубки меньше, чем бульбус пищевода, хвостовой конец тупой
N. americanus	Длина тела около 590 мкм, чехлика - 660 нм	Чехлик заметно исчерчен, особенно в хвостовой части тела, ротовой выступ кажется темным, передний конец тела (но не чехлика) закруглен подобно узкому концу куриного яйца, передняя часть кишечной трубки такого диаметра, как бульбус пищевода, хвостовой конец резко заострен
S. stercoralis	Длина тела около 500 мкм	Личинка без чехлика, пищевод составляет около половины длины тела, хвост тупой или разветвленный
Trichostrongylus sp.	Длина тела около 750 мкм	Просвет кишечника не прямой, а зигзагообразный, хвостовой конец закруглен и имеет форму кнопки

7.7.2. Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов

Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Для дифференциального определения живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей часто используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцирует метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Критерием состояния яйца является окрашивание зародыша, но не оболочки. Такая его способность связана с условиями гибели яйца. В тех случаях, когда волокнистая оболочка в мертвом яйце не теряет свойств полупроницаемости, она не будет пропускать красители, следовательно, мертвый зародыш не будет окрашиваться. Окрашенный зародыш всегда свидетельствует о гибели яйца.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты - 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают; окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц. Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному стеклу при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости; после чего этот же препарат просматривают повторно через 2 - 3 часа. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 часов. Мертвые личинки или не выходят из яиц, или окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).

При определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц возможна окраска препаратов 5%-ным спиртовым раствором йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1 - 3 сек. окрашиваются в оранжевый цвет.

Мертвые яйца описторхисов и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают их сафранином (в разведении 1:10000 спирта 10 °С). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин окрашивает в красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет; яйца с мертвыми зародышами - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином или в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000, или индигокармином в разведении 1:1000 - 1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2 - 7 часов.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски:

1. Бриллианткреазиловый синий (1:8000) - через 1 час у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остальной части яйца.

2. Сафранин (1:8000 при воздействии в течение 2 часов и 1:5000 - в течение 3 - 5 часов).

3. 50%-ный раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 часа при температуре 29 - 30 °С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

7.7.3. Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов

Люминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции используются не ультрафиолетовые лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю ОИ-18 добавляют специальный набор цветных фильтров.

Живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин, ауролин, сульфат берлерина, трипафлавин, риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные, живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая часть; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых - и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет, у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы.

При вторичной люминесценции (при окраске акридин оранжевым в разведении 1:10000 и 1:50000 от 30 минут до 2 часов) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых яиц аскарид, токсокар, остриц, карликовых цепней, крысиных цепней, бычьего цепня, лентецов окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых яиц аскарид, токсаскарисов, крысиного цепня, широкого лентеца и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши яиц этих гельминтов излучают "горящий" оранжево-красный цвет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в "горящий" светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, в ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет.

Живые яйца трематод (парагонимусов и клонорхисов) не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый цвет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10 - 15 минут после гибели проявляются ярким "горящим" светло-зеленым, а затем - оранжево-красным светом.

7.7.4. Метод биологической пробы

Например, для определения жизнеспособности яиц аскаридат (аскариды свиные, человека, токсокары, токсаскарис и др.) на одно животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100 - 300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинки. Через 6 - 7 суток животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют их по методу Бермана или Супряги (раздел 6.1.2).

Если животных заражали живыми инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат.

В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 месяца, у морских свинок - через 50 суток, у мышей - через 35 - 40 суток.

Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20 - 30 суток и исследуют печень на наличие молодых фасциол.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание незараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92 - 96 часов и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника.

Для определения жизнеспособности яиц описторхисов рекомендуется метод (Герман С.М., Бэер С.А., 1984), основанный на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки, что приводит к открыванию крышечки яйца и активному выходу мирацидия в экспериментальных условиях.

Взвесь яиц описторхисов в воде предварительно охлаждают до 10 - 12 °С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19 - 20 °С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100 - 150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5 - 10 минут. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумагой осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-HCl буфере; в буфер добавляют 12 - 13%-ный раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 минут, слегка покачивая. Затем добавляют 2 капли указанной среды. Препарат готов для микроскопирования под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении.

За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2 - 5 минут обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить и посчитать при микроскопировании.

Чаще всего заражение гельминтами происходит через зараженную пищу, воду, а также через немытые руки.

Прямые и косвенные методы диагностики гельминтозов

На сегодняшний день разработано множество методов диагностики гельминтозов, однако всех их можно разделить на две большие группы: прямые и косвенные. К прямым методам диагностики относятся те исследования, которые позволяют непосредственно выявить гельминты, их фрагменты, личинки или яйца. Косвенные методы диагностики гельминтозов основываются на выявлении вторичных изменений, характерных для той или иной разновидности гельминтоза.

Самыми популярными прямыми методами диагностики гельминтозов являются макро- и микрогельминтоскопические методы исследований.

Макрогельминтоскопические методы исследования

Вопросы читателей

18 October 2013, 17:25 Добрый день. Уже около почти год ощущаю зуд вокруг анального отверстия. Никаких болевых ощущений. Подскажите к кому обратится и что это может быть? Спасибо

Задать вопрос

Микрогельминтоскопические методы исследования

Иммунологические методы исследования

Диагностики гельминтозов основаны на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к тем или иным гельминтам. Для иммунологического исследования применяется метод непрямой гемагглютинации, иммуноферментного анализа, иммуноэлектрофореза, иммуноабсорбции и другие серологические методы исследований крови.

Иммунологические методы исследования применяются для диагностики альвеококкоза, эхинококкоза, цистицеркоза, аскаридоза, шистосомоза и других гельминтозов.

Анализ желчи и дуоденального содержимого

Биопсия

Электропунктурная диагностика

Электропунктурная диагностика основана на анализе сопротивления кожи при раздражении ее слабым электрическим током. Электропунктурная диагностика при подозрении на гельминтоз может проводиться двумя способами: по методу Фолля или с помощью резонансного тестирования.

Инструментальные методы исследования

При гельминтозах также проводится ультразвуковое исследование, ФЭДГС, и компьютерная диагностика. Эти методы позволяют определить степень вреда, нанесенного гельминтами, а также определить состояние отдельных органов.

Эффективным и удобным методом гельминтологического исследования является изучение толстого мазка по Като , сущность которого состоит в обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке фекалий, просветленных глицерином и подкрашенных малахитовой зеленью. Состав смеси Като - 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина, 500 мл 6% раствора фенола. Раствор стабилен, может храниться при комнатной температуре. Для приготовления препаратов кусочки фекалий величиной с горошину наносят на предметное стекло, покрывают пленкой гидрофильного целлофана, выдержанного в смеси Като в течение 24 ч, и придавливают его к стеклу для равномерного распределения материала. Просветленные в течение 40-60 мин мазки микроскопируют. Подсчитывают обнаруженные яйца гельминтов и по морфологическим признакам определяют их видовую принадлежность. Метод позволяет выявить яйца аскарид, власоглава, цестод, трематод, в меньшей степени - анкилостомид и карликового цепня.

Широко применяются также методы обогащения . Принцип флотационных методов состоит в суспендировании фекалий в солевом растворе, имеющем большую относительную плотность по сравнению с яйцами гельминтов, вследствие чего они всплывают на поверхность. Под микроскопом исследуется содержимое поверхностной пленки. В качестве обогатительных смесей используют растворы: поваренную соль - 400 г в 1 л воды (относительная плотность по Фюллеборну -1,18); азотнокислый натрий - 1 кг в 1 л воды (относительная плотность по "Калантарян-1,38); азотнокислый натрий - 900 г и азотнокислый калий - 400 г в 1 л воды (относительная плотность по Брудастову и Красноносу-1,48). Приготовленные растворы кипятят и охлаждают.
Для исследования вносят 5-10 г фекалий в стеклянный или фаянсовый стакан, добавляют в него 100-200 мл солевого раствора и тщательно размешивают. Затем удаляют всплывшие крупные частицы деревянным шпателем или совочком из бумаги либо картона и тотчас же прикладывают к поверхностной пленке широкое предметное стекло так, чтобы солевой раствор и предметное стекло полностью соприкасались. После 30-40-минутного отстаивания смеси предметное стекло снимают, кладут под микроскоп пленкой кверху и тщательно просматривают всю поверхность. Во избежание высыхания можно добавить 2-3 капли 50% раствора глицерина. Поверхностную пленку можно снимать также проволочной петлей. Эффективность флотационных методов повышается по мере увеличения относительной плотности солевых растворов. С помощью этих методов можно выявлять яйца нематод, цестод и трематод.

Для обнаружения яиц в фекалиях применяют метод седиментации по Красильникову . Фекалии смешивают с 1 % раствором детергента (стиральный порошок «Лотос» и др.) в соотношении 1:10 до образования суспензии. Под влиянием детергента растворяются различные компоненты фекалий (белки, жиры, тканевые элементы). Через 30 мин содержимое пробирки встряхивают в течение 1-2 мин, после чего центрифугируют 5 мин. Из осадка готовят препараты и просматривают под микроскопом.
В полевых условиях, а также при массовых обследованиях населения на пораженность гельминтами удобно применять метод толстого мазка по Като. В стационарных условиях при обследовании больных предпочтительнее использовать наиболее эффективные флотационные методы. При использовании этих методов в ходе микроскопии целесообразно подсчитывать обнаруженные в препарате яйца. При соблюдении стандартности навески или объема, взятых для исследования фекалий (например, 1 чайная или столовая ложка), и постоянного единого объема солевых растворов можно ориентировочно судить об интенсивности инвазий. Этот количественный учет может быть полезным при обосновании назначенного лечения и оценке эффективности проведенной дегельминтизации. Кроме того, для установления интенсивности инфекции могут быть использованы и другие более точные количественные методы, в частности метод Столла.

Для диагностики тениаринхоза и энтеробиоза применяют метод исследования перианально-ректальных соскобов. Деревянным шпателем, смоченным в 50% растворе глицерина, делают соскоб с перианальных складок утром до дефекации в окружности заднего прохода и нижних отделов прямой кишки. Полученный материал, очищенный со шпателя краем покровного стекла, помещают на предметное стекло в каплю 50% раствора глицерина, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Можно исследовать также полоску целлюлозной ленты, которую вначале прижимают клейкой стороной к пернанальным складкам, затем помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Обнаружение личинок нематод в фекалиях по методу Бермана . Метод основан на термотропном свойстве личинок. Для исследования берут 1 столовую ложку фекалий, помещают их в металлическую сетку или сетку из нескольких слоев марли на проволочном каркасе. Сетку устанавливают в воронку, укрепленную в штативе. К воронке присоединяется резиновая трубка с зажимом. Приподняв сетку, воронку заполняют водой (температура +40°...+50°С) так, чтобы нижняя часть сетки была погружена в воду. Личинки из фекалий активно мигрируют в теплую воду и, оседая, скапливаются в нижней части воронки. Через 2-4 ч зажим открывают, воду спускают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 2-3 мин. Затем сливают надосадочную жидкость, осадок переносят на предметное стекло и просматривают под микроскопом, где отыскивают подвижные личинки возбудителя стронгилоидоза.

Метод Харада и Мори позволяет дифференцировать личинки анкилостом и некаторов. Личинки анкилостомид культивируют на фильтровальной бумаге. С этой целью 0,5 г свежих фекалий, взятых у больного не позже чем через 1 ч после дефекации, наносят на полоски фильтровальной бумаги, размером 12X1,5 см, оставляя оба конца полоски чистыми. Один конец полоски погружают в пробирку, четвертая часть которой заполнена водой, а другой - зажимают пробкой. Пробирки ставят в термостат при температуре +26... + 28°С. Развившиеся из яиц личинки опускаются по фильтровальной бумаге и оседают на дно пробирки. Спустя 5-6 дней полоску бумаги удаляют, а оставшуюся в пробирке жидкость исследуют под лупой либо центрифугируют. Образовавшийся при центрифугировании осадок исследуют под световым микроскопом. При использовании вместо пробирок четырехгранных стеклянных банок (размером 15ХЮХ7 см), к стенкам которых прикрепляют по 4 бумажные полоски, эффективность анализов повышается (Г. М. Ма- руашвили с соавт., 1966).

Методы исследования на шистосомозы . Исследование фекалий - порцию фекалий смешивают с 250 мл воды, процеживают через 3 слоя марли в конический сосуд, который доверху наполняют водой. Через 30 мин слой жидкости сливают, к осадку приливают свежую порцию воды. Осадок промывают до получения прозрачной надосадочной жидкости и микроскопируют.

Метод лярвоскопии - в колбу Эрленмейера с напаянной сбоку стеклянной трубочкой, направленной вверх, помещают 20-25 г фекалий и промывают водопроводной водой. Затем колбу накрывают темной бумагой, оставив на свету напаянную стеклянную трубочку при температуре +25...+30°С. Вылупившиеся мирацидии концентрируются у мениска в боковой трубочке, где их можно видеть с помощью лупы или невооруженным глазом. Исследование мочи -100 мл мочи, собранной в период между 10 ч утра и 14 ч дня, или суточную порцию отстаивают, а затем центрифугируют при 1500 об/мин. Полученный осадок наносят* на предметное стекло и микроскопируют. ВОЗ рекомендует метод фильтрования всей порции мочи. После фильтрования фильтры обрабатывают формалином или подогревают (чтобы убить яйца), а затем увлажняют водным раствором нингидрина. В подсушенных препаратах зародыши яиц приобретают фиолетовую окраску.

Применение иммунологических методов исследования для диагностики шистосомозов связано с трудностями, так как взрослые шистосомы и их яйца содержат большое количество антигенов, вызывающих иммунные реакции, которые не являются видоспецифическими (Д. Бредли, 1979).

В нашей стране для постановки иммунологических реакций при гельминтозах выпускается целый ряд стандартных диагностикумов. Практическое применение имеют аллергическая кожная проба на эхинококкоз и альвеококкоз, РЛА с эхинококковым антигеном, РСК на холоде, реакция преципитации на холоде в различных модификациях (кольцевая преципитация, преципитация в пробирках или капиллярах, которые ставятся с трихинеллезным, цистицеркозным и мигроаскаридозным антигенами). Стандартные диагностикумы для постановки вышеназванных серологических реакций изготавливаются предприятиями по производству бактерийных препаратов. К выпускаемым диагностикумам предприятие-изготовитель прилагает подробные инструкции о правилах хранения, сроках годности препарата и наставления по применению соответствующих антигенов с техникой постановки реакции.

В последние годы перечень серологических реакций, применяемых для диагностики гельминтозов, значительно расширился. В этих целях используются следующие реакции: РИГА, непрямой иммунофлюоресценции (РИФ), иммунодиффузии в геле (РИД), встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), РЭМА. Эти реакции могут использоваться при аскаридозе, токсокарозе, трихинеллёзе, анкилостомидозах, филяриатозах, эхинококкозе и альвеококкозе, опистор- хозе, шистосомозе, парагонимозе. Однако для этих реакции в нашей стране,не выпускаются стандартные диагностикумы и не регламентирована техника их постановки. Отдельные лаборатории, в основном научные, готовят самостоятельно специфические антигены и применяют их в различных модификациях. Описание этих методов широко представлено в литературе и не является строго унифицированным. Интерпретация данных иммунологического анализа должна основываться на изучении динамики иммунного ответа с учетом уровня специфичности и чувствительности каждой применяемой серологической реакции. Поэтому при постановке диагноза, а также при сероэпидемиологических обследованиях населения целесообразно пользоваться несколькими наиболее чувствительными реакциями. С этих позиций хорошо зарекомендовали себя реакции ВИЭФ и РЭМА, которые отличаются высокой чувствительностью и достаточно высокой специфичностью (П. Амбруаз-Тома, 1978; И. Е. Баллад, 1979; Г. М. Негряну, 1980; А. М. Пономарева, 1981; А. Я. Лысенко, 1978, и др.). Эффективность РЭМА проверена при амебиазе, лейшманиозе, трипаносомозе и токсоплазмозе (Г. А. Ермолин, 1980).

Исходный уровень знаний и навыков.

Учащийся должен знать:

1. Представителей трематод описторха, парагонима, фасциолу, дикроцелия.

2. Жизненные циклы, пути заражения трематод, клиническую картину болезни, сроки хранения фекалий

Учащийся должен уметь:

1. Определить яйца трематод по рисункам, таблицам.

2. Формировать меры профилактики.

3. Приготовить нативный мазок, большой мазок, мазок по Като, оценить свою работу, работать с микроскопом.

4. Определять яйца трематод в препаратах, соблюдать правила охраны труда, соблюдать правила сан.-эпид. режима.

Структура занятия:

Теоретическая часть:

Ø Микролекция.

Практическая часть:

Ø Приготовление нативного мазка, большого мазка, мазка по Като, оценка работы, микроскопия

Микролекция.

Сбор и доставка материала

Окончательный диагноз гельминтозов может быть установлен только с учетом результатов лабораторных исследований. Основным методом лабораторной диагностики гельминтозов является обнаружение яиц или личинок гельминтов в фекалиях, моче, крови и других биологических жидкостях при микроскопическом исследовании. Материалами для исследований служат испражнения, содержимое двенадцатиперстной кишки, кровь, мокрота, биопсированные ткани и другие материалы.

Сбор материала для исследования производят в чистую стеклянную или пластиковую посуду, которая сопровождается направлением с указанием ФИО обследуемого. При массовом обследовании допускается сбор фекалий в стаканчики из парафинированной бумаги, целлофановые пакеты.

Испражнения для анализов должны доставляться в лабораторию непозднее одних суток, а при подозрении на стронгилоидоз - немедленно после их выделения. При нарушении этого правила постановка диагноза в связи с разрушением яиц или личинок нередко становится трудной или невозможной.

Для выявления яиц и личинок некоторых видов гельминтов используют специальные методы: метод Бормана, перианальный соскоб, метод мазков-отпечатков с помощью липкой ленты, культивирование личинок на фильтровальной бумаге (метод Харада и Мори) и др.

Практическая часть:

Наиболее распространенным методом исследования фекалий на наличие в них яиц гельминтов являются методы нативного мазка, толстого мазка под целлофаном и большого мазка.

При изучении яиц гельминтов под микроскопом целесообразно сопоставлять видимое изображение с его характеристикой в определителе яиц гельминтов.

Метод нативного мазка

Оборудование:

предметные стекла;

широкая кювета;

пластиковые палочки;

карандаш;

50 %-ный водный раствор глицерина (смешивают равные части глицерина и дистиллированной воды);

сосуд с 0,5% -ным раствором полидеза;

микроскоп.

Ход работы

1. Разложить предметные стекла в кювете, пронумеровать предметные стекла.

2. Нанести пипеткой по 2 капли 50 %-ного водного раствора глицерина на расстоянии 4 см одна от другой на предметные стекла.

3. Взять палочкой кусочек фекалий, размером со спичечную головку (30-50 мг), внести его в каплю глицерина и растереть до равномерной суспензии.

4. На каждом стекле готовят по два нативных мазка, которые не должны сливаться между собой и не доходить до краев, чтобы не испачкать пальцы лаборанта. Для каждой пробы используют новые палочки.

5. Препараты, не накрывая покровными стеклами, исследовать под микроскопом (объектив 8х, окуляр 10-15х).

6. По окончании исследования погрузить препараты в сосуд с 0,5% -ным раствором полидеза.

Метод толстого мазка под целлофаном.

Метод предложен К. Като, М. Миуром в 1954 г. Мазок представляет собой слой неразбавленных фекалий на предметном стекле, спрессованный под листком тонкого гигроскопического целлофана, пропитанного глицерином.

Рис. Приготовление толстого мазка под целлофаном:

а - нативный мазок; б - придавливание резиновой пробкой комочка фекалий, покрытых целлофаном; в - толстый мазок под целлофаном (по Ю.А. Березанцеву и Е.Г.Автушенко, 1976)

Оборудование:

широкая кювета;

полоски целлофана 22x30 мм, обработанные смесью Като в течение 24 ч;

смесь Като (3 % -ный раствор малахитового зеленого -6 мл, 6 % -ный раствор фенола - 500 мл, глицерин - 500 мл, 3,5 мл смеси хватает на 100 полосок);

резиновые пробки крупные;

пинцет анатомический;

пластиковые палочки;

карандаш;

микроскоп.

Ход работы

1. Разложить в кювете предметные стекла, пронумеровать предметные стекла.

2. Набрать палочкой фекалии размером с полгорошины (50-60 мг) и поместить на предметное стекло в центр.

3. Достать из банки пинцетом целлофановую полоску, обработанную по Като, и наложить на пробу кала на предметном стекле.

4. Придавить целлофан резиновой пробкой, чтобы кал распределился равномерно, не вытекая за края полоски.

5. Оставить препарат до просветления на 60 мин и затем исследовать под микроскопом (объектив 8-40х, окуляр 10х).

6. По окончании исследования препарат опустить в сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза.

7. Убрать рабочее место, вымыть руки.

Метод большого мазка.

Метод был предложен Ю.А. Березанцевым и Е.Г. Автушенко в 1973 г. Суть метода основывается на применении бинокулярного микроскопа и нативного мазка на стекле 6x9 см, позволяющего одномоментно исследовать до 200-300 мг кала.

Оборудование:

предметные стекла 6x9 см и 7x10 см;

пластиковые палочки;

50 %-ный раствор глицерина (глицерин и дистиллированная вода в равных частях);

сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза;

микроскоп;

эмалированная кювета;

карандаш.

Ход работы

1. Разложить предметные стекла 7x10 см в кювете, пронумеровать предметные стекла.

2. Затем на каждое предметное стекло положить второе предметное стекло 6x9 см.

3. Нанести пипеткой на предметное стекло размером 6x9 см 15-20 капель 50 % -ного раствора глицерина.

4. Взять палочкой из разных мест кусочки кала величиной со среднюю горошину (200-300 мг) и опустить его в раствор 50 %-ного глицерина на предметном стекле.

5. Растереть палочкой кусочек кала в глицерине до равномерной суспензии, чтобы занимаемая им площадь составляла около 33-34 см 2 . Мазок не покрывать покровными стеклами.

6. Взять большое покровное стекло 7x10 см за края вместе с находящимся на нем большим мазком (чтобы не запачкать пальцы).

7. Исследовать большой мазок при увеличении 34х (объектив 2х, окуляр 17х) и 50х (объектив 4х, окуляр 12,5х). В сомнительных случаях исследования проводят на большом увеличении.

8. По окончании исследования препарат опустить в сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза.

9. Убрать рабочее место, вымыть руки.

При таком методе исследования определяются крупные яйца гельминтов (аскариды, власоглава, анкилостомид, острицы, лентеца широкого, тениид, фасциолы). Они выглядят несколько иначе, в связи с чем необходим некоторый опыт, чтобы их быстро обнаружить. Большие мазки можно применять для исследования на яйца шистосом и личинок угрицы кишечной. Большой мазок содержит в 6-10 раз больше исследуемого материала, чем нативный мазок. Во столько же раз выше его эффективность.

Похожая информация.

Методы гельминтологических исследований делятся на прямые и косвенные. Прямые методы: выявление самих гельминтов, их фрагментов, яиц, личинок в фекалиях, моче, дуоденальном секрете, мокроте, носовой и влагалищной слизи, содержимом подногтевых пространств, биопсированных кусочках ткани. Косвенные методы: выявление вторичных изменений, возникающих в организме человека в результате жизнедеятельности паразита, серологическими реакциями, общим исследованием крови, мочи. Наиболее распространенными методами исследования фекалий являются гельминтоовоскопические и протозооскопические. При диагностике нельзя каким-либо одним методом выявить яйца или личинки всех видов гельминтов, обитающих в пищеварительной системе человека. Так, при использовании метода флотации в поверхностную пленку не всплывают (из-за высокого удельного веса) яйца трематод, в некоторых случаях неоплодотворенные яйца аскарид. В кале очень редко можно обнаружить яйца остриц, онкосферы тениид, которые выявляются специальными методами исследований: соскоб с перианальных складок для остриц и тениид, методы осаждения для трематод (яйца описторха и др.). Поэтому для целенаправленного обследования больного на гельминтозы врач в направлении должен указать, на какие гельминты следует обратить основное внимание (диагноз), что позволит лаборанту выбрать соответствующую методику для выявления данного вида гельминта. Фекалии, взятые из разных мест испражнений в количестве не менее 50 граммов (чайная ложка) в чистую стеклянную посуду, должны быть отправлены в лабораторию не позднее чем через сутки после дефекации и исследованы в день поступления. В случае необходимости сохранения кала до следующего дня его помещают в холодное место (0-4°С) или заливают одним из консервантов. Перед исследованием кал перемешивают палочкой, чтобы яйца гельминтов оказались равномерно распределенными в общей массе. При обнаружении в препарате яиц какого-либо гельминта просмотр не прекращают, т.к. может быть двойная или тройная инвазия. Контроль за эффективностью лечения гельминтозов осуществляется путем исследования фекалий на яйца гельминтов через 2-3 недели или через 2-3 месяца после лечения в зависимости от обнаруженного гельминта. Макроскопические методы служат для обнаружения в кале целых половозрелых гельминтов или их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы. Часто на поверхности кала после дефекации можно видеть активно ползающих остриц; выделяются с калом аскариды; иногда люди сами замечают отхождение гельминтов. У больных дифиллоботриозом могут выделяться обрывки стробилы лентеца (в виде "лапши"), а у инвазированных тениидами (свиной или бычий цепень) с калом часто отходят членики гельминтов (в виде "белых обсечек") или они активно выползают из анального отверстия. Макроскопический метод является основным для дифференциальной диагностики тениидоза и тениаринхоза (в сочетании с опросом). Из специальных макроскопических методов применяется метод последовательного промывания фекалий. Фекалии размешиваются в воде для получения равномерной суспензии, после чего при хорошем освещении их тщательно просматривают отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или на темном фоне в чашках Петри. Пинцетом или препаровальной иглой извлекают все подозрительные белые частицы, крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, и рассматривают их под лупой между двумя предметными стеклами. Мелких гельминтов или головки цестод рассматривают под лупой в капле глицерина или под микроскопом. При использовании этого метода для диагностики члеников свиного, бычьего цепней, широкого лентеца отмытые членики помещают между двумя стеклами и, просматривая на свет под лупой или малым увеличением микроскопа, определяют видовую принадлежность по строению матки (у зрелого членика свиного цепня от центрального ствола отходят 8-12 боковых ответвлений, а у бычьего цепня 18-32, чаще 28-32, у широкого лентеца членики больше в ширину и матка в центре в виде "розетки"). Если матку плохо видно, то ее предварительно можно подержать некоторое время в 50% растворе глицерина, после чего даже запустевшие стволы матки просматриваются хорошо. При определении этих цестод по строению отошедших головок их с шейкой осторожно кладут в каплю глицерина между предметными стеклами (или покрывают покровным стеклом) и, не передавливая, рассматривают под микроскопом при малом увеличении.

Микроскопические методы подразделяются на простые, сложные и специальные.

К простым относятся методы нативного мазка, нативный мазок раствором Люголя, методы толстого мазка под целлофаном по Като, закручивания (по Шульману) и перианального соскоба.

Сложные методы являются более эффективными и основаны на концентрации яиц в препаратах. Они включают в себя предварительную обработку фекалий жидкими реактивами, в результате чего яйца гельминтов или выпадают в осадок, или всплывают на поверхность жидкости.

К сложным методам относятся методы обогащения:

а) флотационные (когда удельный вес яиц меньше удельного веса солевого раствора и яйца всплывают в поверхностную пленку);

б) седиментационные (когда удльный вес яиц больше удельного веса солевых растворов и яйца оседают в осадок).

Специальными методами обнаружения яиц и личинок гельминтов, цист и вегетативных форм простейших являются методы соскоба, флотации, седиментации, ларвоскопии, протозооскопии, исследование желчи и методы окраски мазков кала, мокроты и др.